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1、关于基因工程基本流程关于基因工程基本流程筛选与鉴定筛选与鉴定第1页，讲稿共56张，创作于星期日21.抗抗药药性性筛选筛选法法pBR322质质粒上有两个抗生素抗性基因粒上有两个抗生素抗性基因:Tetr和和Ampr。Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。基于基于载载体体遗传标记遗传标记的的筛选筛选与与鉴鉴定定 原理：原理：第2页，讲稿共56张，创作于星期日3第3页，讲稿共56张，创作于星期日4第4页，讲稿共56张，创作于星期日5（1）四）四环环素：素：（2）氨）氨苄苄青霉素抗性基因：青霉素抗性基因：pBR322抗生素抗生素标记选择标
2、记选择产产生生-内内酰酰胺胺酶酶，使氨，使氨苄苄青霉素青霉素转变为转变为青霉青霉酮酮酸，酸，使碘使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Ampicillin）（）（蓝蓝灰色）灰色）褪色。褪色。抑制抑制细细菌生菌生长长，但不，但不杀杀死死细细菌。菌。杀杀死生死生长长的的细细菌，但不菌，但不杀杀死停止生死停止生长长的的细细菌。菌。（3）环丝环丝氨酸：氨酸：第5页，讲稿共56张，创作于星期日6选择过选择过程程如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导导致四致四环环素抗性基因素抗性基因失活，可用失活，可用四四环环素加素加环丝环丝氨酸氨酸平板培养基平板培养基选择选择重重组组克隆。克隆。Te
3、tr失活的菌生失活的菌生长长被四被四环环素抑制，不被素抑制，不被环丝环丝氨酸氨酸杀杀死，保留下来；死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四不失活的菌抗四环环素，能分裂生素，能分裂生长长，反而被，反而被环丝环丝氨酸氨酸杀杀死。死。（1）四）四环环素抗性插入失活素抗性插入失活第6页，讲稿共56张，创作于星期日7无无环丝环丝氨酸培养基氨酸培养基第7页，讲稿共56张，创作于星期日8（2）氨）氨苄苄青霉素抗性插入失活青霉素抗性插入失活选择过选择过程程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导导致氨致氨苄苄青霉素抗性青霉素抗性基因失活，可用碘基因失活，可用碘-青霉素指示液青霉素指示液选择选择。第8页，讲稿
4、共56张，创作于星期日92.-半乳糖苷半乳糖苷酶酶显显色反色反应筛选应筛选法法-半乳糖苷半乳糖苷酶酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯氯靛靛蓝蓝+深深蓝蓝色色原理原理载载体体上上有有一一段段-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（Lac Z）的的 片片段段（氨氨基基端端），其上有外源其上有外源DNA的插入位点。的插入位点。受受体体菌菌基基因因组组中中有有突突变变的的-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（片片段段缺缺失失）。可可以以被被IPTG诱诱导导表表达达。载载体体和和受受体体菌菌基基因因组组可可以以互互补补形形成成完完整整有有功功能的能的-半乳糖苷半乳糖苷酶酶。第9
5、页，讲稿共56张，创作于星期日10选择过选择过程程第10页，讲稿共56张，创作于星期日11-半乳糖苷半乳糖苷酶酶使使X-gal分解成分解成蓝蓝色色产产物。物。第11页，讲稿共56张，创作于星期日123.营营养缺陷型养缺陷型筛选筛选法法原理原理载载体体能能够够合成某些生合成某些生长长必必须营须营养成分，养成分，受体菌基因突受体菌基因突变变不能合成不能合成这这种生种生长长必必须须的的营营养物养物质质。在在缺缺少少该该营营养养物物质质的的培培养养板板上上涂涂布布细细菌菌，长长出出的的菌菌落落均均含含有有载载体的，是否重体的，是否重组组子需子需进进行第二行第二轮筛选轮筛选。第12页，讲稿共56张，创作
6、于星期日13选择过选择过程程营养缺陷型受体营养缺陷型受体营养合成型载体营养合成型载体第13页，讲稿共56张，创作于星期日144.噬菌斑噬菌斑筛选筛选法法原理原理以以-DNA为为载载体体的的重重组组DNA分分子子经经体体外外包包装装后后转转染染受受体体，转转化子在培养板上形成噬菌斑。化子在培养板上形成噬菌斑。取代型取代型载载体，噬菌斑即体，噬菌斑即为为重重组组子；子；插入型插入型载载体需体需进进行二次行二次选择选择第14页，讲稿共56张，创作于星期日15选择过选择过程程第15页，讲稿共56张，创作于星期日16基于克隆片段序列的筛选与鉴定基于克隆片段序列的筛选与鉴定1.PCR鉴鉴定法定法 原理：原
7、理：针针对对已已知知目目的的片片段段特特异异性性扩扩增增。包包括括：区区分分重重组组子子与与非非重重组组子子、期期望望重重组组子子与与非非期期望望重重组组子子、目目的的片片段是否整合在受体基因段是否整合在受体基因组组上。上。PCR鉴鉴定法不适用于大定法不适用于大规规模模转转化子的化子的鉴鉴定。定。第16页，讲稿共56张，创作于星期日17选择过选择过程程1）从重）从重组组克隆中提取克隆中提取质质粒（或基因粒（或基因组组DNA）2）用相）用相应应引物引物进进行行PCR反反应应3）电电泳泳PCR产产物物4）检查检查是否有是否有PCR产产物物5）PCR产产物的物的长长度是否与外源基因一致度是否与外源基
8、因一致原理原理图图p58第17页，讲稿共56张，创作于星期日182.Southern blot杂杂交交 原理：原理：从从宿宿主主细细胞胞中中提提取取DNA（或或质质粒粒载载体体），再再用用特特异异性性探探针针（与与目目的的基基因因同同源源）进进行行核核酸酸杂杂交交。只只有有带带有有插插入入片片断断的重的重组载组载体才能与探体才能与探针杂针杂交，在底片上曝光交，在底片上曝光显显示。示。第18页，讲稿共56张，创作于星期日19选择过选择过程程Southern blot流程流程第19页，讲稿共56张，创作于星期日203.菌落菌落/噬菌斑原位噬菌斑原位杂杂交交 原理：原理：特异性探特异性探针针（与目的
9、基因同源）（与目的基因同源）进进行的核酸行的核酸原位原位杂杂交交第20页，讲稿共56张，创作于星期日21探针的制备及标记，探针的制备及标记，p60选择过选择过程程第21页，讲稿共56张，创作于星期日224.R-环检测环检测法法 原理：原理：DNA-RNA杂杂交：交：外源基因的外源基因的mRNA与重与重组载组载体体杂杂交交第22页，讲稿共56张，创作于星期日23选择过选择过程程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时双链变性，复性的时候，候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。双链更稳定。电镜下可见一种电镜下可见一种R-环形结构。环形结构。第23页，讲稿
10、共56张，创作于星期日24缺点：需要缺点：需要电镜电镜第24页，讲稿共56张，创作于星期日255.Northern blotting 原理：原理：从从宿宿主主细细胞胞中中提提取取RNA，再用探再用探针杂针杂交。交。主主要要检检测测插插入入片片断断是是否否被被转录转录。检测检测表达表达载载体。体。第25页，讲稿共56张，创作于星期日26选择过选择过程程Northern blot流程流程第26页，讲稿共56张，创作于星期日276.直接直接电电泳泳检测检测 原理：原理：有插入片段的重有插入片段的重组载组载体分子量比野生型体分子量比野生型载载体分子量大体分子量大第27页，讲稿共56张，创作于星期日28
11、选择过选择过程程从转化后的菌从转化后的菌体克隆中分离体克隆中分离质粒，电泳、质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。分子量分子量 Marker载载体体重重组组克隆克隆第28页，讲稿共56张，创作于星期日297.限制性限制性酶酶切切图谱图谱法法限制性限制性酶酶切切图谱图谱：核酸：核酸经经限制性内切限制性内切酶酶消化成片段，用消化成片段，用电电泳方法泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱带图谱。第29页，讲稿共56张，创作于星期日30在外源片段大小及限制性在外源片段大小及限制性酶酶切切图谱图谱已知的条件下，已知的条件下，选择选择一一两种内切两种内切酶酶切割
12、切割载载体，体，电电泳后比泳后比较电较电泳泳结结果果(DNA条条带带数目数目和分子大小）差异和分子大小）差异进进行区分。行区分。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。泳后比较结果是否符合预计的结果。原理：原理：第30页，讲稿共56张，创作于星期日31ABA或或B第31页，讲稿共56张，创作于星期日32不同克隆的不同克隆的酶酶切切结结果果第32页，讲稿共56张，创作于星期日33选择过选择过程程第33页，讲稿共56张，创作于星期日348.DNA序列序列测测定定 原理：原理：通通过对过对插入片段序列
13、的插入片段序列的测测定确定是否是所需的重定确定是否是所需的重组组子子第34页，讲稿共56张，创作于星期日35选择过选择过程程双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法化学降解法化学降解法焦磷酸降解法焦磷酸降解法高通量高通量Solexa测序测序第35页，讲稿共56张，创作于星期日36第36页，讲稿共56张，创作于星期日37基于外源基因表达产物的筛选与鉴定基于外源基因表达产物的筛选与鉴定1.蛋白蛋白质质功能功能检测检测 原理：原理：外外源源基基因因编编码码具具有有特特殊殊功功能能的的酶酶或或活活性性蛋蛋白白，根根据据抗抗原原抗抗体体反反应应原原理理，针针对对该该表表达达产产物物设设计计相相应应的的检检测测方
14、案方案针对针对表达表达载载体的体的检测检测方法方法第37页，讲稿共56张，创作于星期日38待待测测基因基因 产产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记标记的二的二 抗抗结结合蛋白合蛋白固相支固相支持持滤滤膜膜待待测测基因基因 产产物蛋白物蛋白一抗一抗125I标记标记的二抗的二抗固相支持固相支持滤滤膜膜待待测测基因基因 产产物蛋白物蛋白一抗一抗固相支持固相支持滤滤膜膜固相支持固相支持滤滤膜膜待待测测基因基因 产产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记标记的二抗的二抗 结结合蛋白合蛋白125I标记标记的二抗的二抗第38页，讲稿共56张，创作于星期日39选择过选择过程程1)弥弥补补缺陷缺陷转
15、转化化进进来的外源基因来的外源基因产产物能物能够够弥弥补补受体菌受体菌株的突株的突变变型缺陷。型缺陷。his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含在不含组组氨酸的培养氨酸的培养基中生基中生长长第39页，讲稿共56张，创作于星期日40例：小鼠的二例：小鼠的二氢氢叶酸叶酸还还原原酶酶（DHFR）对对三甲氧三甲氧苄苄二二氨氨嘧啶嘧啶有抗性。有抗性。DHFR载载体体连连接接转转化受化受体菌体菌三甲氧三甲氧苄苄二氨二氨嘧啶嘧啶培养基平板培养基平板含含DHFR的克隆才能生的克隆才能生长长2)增加新性状增加新性状使被使被转转化的受体菌表化的受体菌表现现出外源基因的表型。出外源基因的表型。第40
16、页，讲稿共56张，创作于星期日3)酶酶活性活性检测检测针对针对外源基因表达外源基因表达产产物是物是酶酶。扩扩散免疫沉淀散免疫沉淀检测检测分泌型分泌型产产物物原理：抗原原理：抗原抗体凝集反抗体凝集反应应方方法法：把把非非放放射射性性抗抗体体加加到到平平板板培培养养基基中中，当当插插入入基基因因的的表表达达产产物物被被细细菌菌分分泌泌到到菌菌落落周周围围时时，就就会会与与抗抗体体反反应应形成形成“沉淀圈沉淀圈”。第41页，讲稿共56张，创作于星期日42对对于不能被分泌到菌体外的蛋白于不能被分泌到菌体外的蛋白质质可先可先进进行原位溶菌行原位溶菌处处理（溶菌理（溶菌酶酶、原噬菌体、原噬菌体诱发诱发）。
17、）。第42页，讲稿共56张，创作于星期日43酶酶联联免疫吸附免疫吸附测测定（定（ELISA）原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）：与目）：与目标标分子的特异分子的特异结结合。合。二抗（二抗（secondary antibody）：）：与一抗的特异性与一抗的特异性结结合。合。酶酶连连（enzyme-linked）二抗：）二抗：携携带带能催化无色底物能催化无色底物转变为转变为有色物有色物质质（或（或发发光）的光）的酶酶，再通，再通过过比比色色测测定有色物定有色物质质的含量（或光的含量（或光强强度），从而推度），从而推测测目目标标分子的含量。分子的含量。第43页，讲稿共56张，
18、创作于星期日44待待测测基因基因 产产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待待测测基因基因 产产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗无色的底物无色的底物有色的有色的产产物物比色比色观观察察酶酶 第44页，讲稿共56张，创作于星期日45方法：方法：固定固定样样品品一抗一抗结结合合二抗二抗结结合合显显色色/发发光反光反应应比色比色第45页，讲稿共56张，创作于星期日462.放射免疫原位放射免疫原位检测检测利用抗体作利用抗体作为为“探探针针”原位原位检测转检测转入受体菌并且表达入受体菌并且表达出相出相应应的蛋白的蛋白质质的外源基因。的外源基因。蛋白蛋白蛋白蛋白杂杂交交 原理：原理：第46页，讲稿共56张，创作
19、于星期日47选择过选择过程程第47页，讲稿共56张，创作于星期日483.western blotting蛋白蛋白蛋白蛋白杂杂交交 原理：原理：选择过选择过程程western blot过过程程第48页，讲稿共56张，创作于星期日49多抗多抗Blotting结结果果单单抗抗blotting结结果果第49页，讲稿共56张，创作于星期日504.蛋白凝胶蛋白凝胶电电泳泳待待筛选筛选克隆与非重克隆与非重组组子同子同时进时进行蛋白行蛋白质电质电泳，泳，电电泳泳结结束后通束后通过过染色染色对对比相比相应应条条带带辨辨识识重重组组子。适合受体蛋子。适合受体蛋白表达种白表达种类较类较少，外源基因高效表达的体系。少
20、，外源基因高效表达的体系。原理：原理：第50页，讲稿共56张，创作于星期日51选择过选择过程程SDS-PAGE，染色，染色不适于不适于筛选筛选第51页，讲稿共56张，创作于星期日525.转译筛选转译筛选法法 借助无借助无细细胞翻胞翻译译系系统统，通，通过过表达或抑制所表达或抑制所选择选择的克隆的克隆载载体体上的外源基因的上的外源基因的转录转录，来，来筛选筛选其其产产物是否符合物是否符合预预期。适用期。适用于于mRNA转录转录丰度高的外源基因。丰度高的外源基因。原理：原理：第52页，讲稿共56张，创作于星期日53选择过选择过程程mRNA无无细细胞翻胞翻译译系系统统35S标记标记的的 甲硫氨酸甲硫
21、氨酸翻翻译译35S标记标记的的肽链肽链PAGE电电泳泳放射自放射自显显影影比比较较放射性放射性 带纹带纹的位置的位置载载体体+外源外源DNA转录转录与与预预期期的的产产物物分分子子量相符？量相符？第53页，讲稿共56张，创作于星期日546.DNA-蛋白蛋白质质相互作用相互作用筛选筛选检测检测能同能同DNA特异特异结结合的蛋白合的蛋白质质因子。因子。ChIP、EMSA、甲基化干、甲基化干扰实验扰实验第54页，讲稿共56张，创作于星期日55待待测测蛋白蛋白质质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白能与蛋白质结质结 合的合的DNA序列序列放射性放射性标记标记待待测测蛋白蛋白质质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白能与蛋白质结质结 合的合的DNA序列序列放射性放射性标记标记 原理：原理：第55页，讲稿共56张，创作于星期日感谢大家观看第56页，讲稿共56张，创作于星期日