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1、关于发酵工程在现代生物技术中的应用第1页，讲稿共49张，创作于星期日第 一节 基因工程菌的发酵就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。第2页，讲稿共49张，创作于星期日（一）工程菌的稳定性 1、基因工程菌不稳定的表现生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，失去制造
2、外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。定性。基因的不稳定性原因：基因的不稳定性原因：质粒分离丢失、质粒分离丢失、结构不稳定性结构不稳定性表达产物的不稳定性（宿主细胞调节突变）表达产物的不稳定性（宿主细胞调节突变）第3页，讲稿共49张，创作于星期日质粒丢失质粒丢失 当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。质当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。质粒可分为高拷贝质粒（粒可分为高拷贝质粒（20拷贝拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝
3、质粒有专门时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细粒，几乎所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低胞没有接受质粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。的（每百万细胞分裂中一个）。第4页，讲稿共49张，创作于星期日但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在
4、无质粒细胞，例如质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有发酵液，每毫升有109个细胞，个细胞，总共就有总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。个无质粒细胞。质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。一起形成一个单位。第5页，讲稿共49张，创作于星期日第6页，讲稿共49张，创作于星期日质粒结构不稳定性质粒结构不稳
5、定性 除了分离不稳定性问题外，除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但质粒结某些细胞保留质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响，减少对细胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素这就是结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的质比原来的工程菌更快，使得在这
6、种培养物中带有改变了的质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳定性。粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳定性。第7页，讲稿共49张，创作于星期日表达产物的不稳定性表达产物的不稳定性宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通常改宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。
7、乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。入细胞，从而不能启动细胞的表达。第8页，讲稿共49张，创作于星期日2、培养条件对工程菌稳定性的影响 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键进行工业化生产的关键 步骤。步骤。在众多的
8、环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3 3个方面尤其重要。个方面尤其重要。环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。第9页，讲稿共49张，创作于星期日1）培养基的组成 第10页，讲稿共49张，创作于星期日2）菌体比生长速率 比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。能与克隆菌本身和培养条件有关。例如例如:在酵母系统中，在酵母系统中，大则质粒大则质粒pJDB248pJD
9、B248稳定性高。稳定性高。如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。但很难达到但很难达到第11页，讲稿共49张，创作于星期日3）培养温度通常，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。通常，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。4）pH和溶解氧pHpH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应
10、根据工程菌的生长和代谢情况，对以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pHpH进行适当的调节进行适当的调节溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2DO2值。值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。提高活菌产量。第12页，讲稿共49张，创作于星期日4、控制基因过量表达 提高质粒稳定性的目
11、的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。可采用可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。率使外源基因高效表达。第13页，讲稿共49张，创作于星期日1）可诱导性启动子 在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：laclac
12、、trptrp、P PL L等等 在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高效表达。效表达。例如：利用利用3-3-吲哚乙酸可使吲哚乙酸可使trptrp启动子去阻遏启动子去阻遏第14页，讲稿共49张，创作于星期日2）温度敏感型质粒 一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增到一定值时质粒大量扩增 脱缰质粒（runa
13、way plasmid）如：如：pKN410pKN410在在3030时的拷贝数为时的拷贝数为202050/50/E.coliE.coli细胞；在细胞；在3535时质时质粒大量复制。粒大量复制。将将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增400400倍。倍。第15页，讲稿共49张，创作于星期日5、施加选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。第16页，讲稿共49张，创作于星期日1）抗生素添加法通常在重组质粒上
14、含有抗药性基因通常在重组质粒上含有抗药性基因第17页，讲稿共49张，创作于星期日AmpR第18页，讲稿共49张，创作于星期日AmpR TcR第19页，讲稿共49张，创作于星期日 将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后，将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后，克隆菌也获得了抗药性。克隆菌也获得了抗药性。在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，就可在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。第20页，讲稿共49张，创作于星期日但这种方法在大规模生产时并不可取,因为：成本增加成本增加对于一些易
15、被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的选对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的选择压力只能维持一定的时间择压力只能维持一定的时间添加抗生素对结构性不稳定无能为力添加抗生素对结构性不稳定无能为力抗生素的存在可能会影响目的产物的合成给产物的提取带来困难抗生素的存在可能会影响目的产物的合成给产物的提取带来困难第21页，讲稿共49张，创作于星期日2）抗生素依赖变异法 通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖型变异株通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖型变异株即只有在即只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长。该抗生素存在时宿主细胞才能生长。因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能
16、达到消因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能达到消除重组质粒分配不稳定性除重组质粒分配不稳定性 的目的。的目的。而重组质粒上含该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主而重组质粒上含该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。第22页，讲稿共49张，创作于星期日3）营养缺陷型法 通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入到重组质粒中。基因插入到重组质粒中。然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能
17、存活，然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。而只有含重组质粒的细胞才能生长。例如：构建构建 带有色氨酸操纵子的重组质粒带有色氨酸操纵子的重组质粒pBR322-trppBR322-trp，并在该质粒上插入，并在该质粒上插入SerBSerB基因；而宿主细胞是基因；而宿主细胞是SerBSerB缺陷型；这样质粒与宿主形成互补，在培养缺陷型；这样质粒与宿主形成互补，在培养过程中丢失质粒的细胞因不能合成过程中丢失质粒的细胞因不能合成SerSer而被淘汰而被淘汰.第23页，讲稿共49张，创作于星期日（二）、工程菌发酵工艺（二）、工程菌发酵工艺 不同发酵条件下工
18、程菌发酵结果不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量通气量 搅拌转速搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间诱导时间 菌体湿重菌体湿重 蛋白量蛋白量1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8%2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7%3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2%4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4%5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%*鲤鱼生长激素基因工程菌鲤鱼生长激素基因工程菌第24页，讲稿共49张，创作于星期日1、培养基培养基给重组菌提供必需的营养和适宜的
19、环境，对重组菌的生长、质粒的稳定及产物的表达有极其重要的影响，同时还要考虑到目的产物的提取和纯化工艺。人畜的蛋白质发酵营养丰富容易质粒丢失第25页，讲稿共49张，创作于星期日2 2、溶氧浓度对工程菌发酵的影响、溶氧浓度对工程菌发酵的影响在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现当在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现当 发酵液发酵液的溶氧为的溶氧为1.82.6ppm/L时，菌体湿重为时，菌体湿重为1.92.08g/L外源基因表达量为外源基因表达量为13.8%16.7%，而当，而当溶氧值提高到溶氧值提高到4.0ppm/L时菌体湿重为时菌体湿重为2.27g/L外源外源基因表达量为基因表达量为26.
20、4%。在诱导表达期间，要维持外源。在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量代谢基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转以促进呼吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长而且速以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。有利于外源蛋白产物的形成。第26页，讲稿共49张，创作于星期日3、比生长速率 基因工程菌在培养过程中的比生长速率与重组产物的表达速率存在一定的关系，过高或过低的比生长速率均不利第27页，讲稿共49张，创作于星期日4 4、诱导时间对外源蛋白
21、表达的影响、诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间诱导时间：加入诱导剂后的培养时间：加入诱导剂后的培养时间随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。率下降，甚至产物被分解。诱导时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间诱导时间 酶活力酶活力 酶表达水平酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37%2 118.8 57%3 120.8 67%4 165.0 68%5 139.9 64%*L-天冬酰氨酶天冬酰氨
22、酶第28页，讲稿共49张，创作于星期日5 5、代谢副产物的影响、代谢副产物的影响 当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代谢的作用产生的认为细菌在低比生长速率下通过氧化代谢的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，
23、而在髙比能量足以满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备必须通过乙酸生成途径储备ATP和和NADH。第29页，讲稿共49张，创作于星期日(三)、安全问题关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。第30页，讲稿共49张，创作于星期日1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，制定了有关DNA重
24、组实验的准则，其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。第31页，讲稿共49张，创作于星期日物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密
25、封要求最严格。第32页，讲稿共49张，创作于星期日第二节 动、植物细胞大规模培养动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。第33页，讲稿共49张，创作于星期日一、细胞融合技术细胞融合技术（细胞融合技术（cell fusion technology)，是指两个或更多个亲本细胞经酶法出去细胞壁得到两个球状原生质球，通过生物法、化学法或物理法等诱导融合形成单个细胞，获得新的重组子的过程。第34页，讲稿共49张，创作于星期日u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发
26、和利用具有深远的意义。对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制
27、备。第35页，讲稿共49张，创作于星期日生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子几
28、种细胞融合成功的例子第36页，讲稿共49张，创作于星期日细胞的融合过程细胞的融合过程植物细胞融合过程植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图人造小鼠培育过程示意图第37页，讲稿共49张，创作于星期日（一）原生质体的制备影响原生质体制备的因素：1、亲本的选择及预处理 微生物细胞取对数期细胞，培养基中加入细胞壁合成抑制剂，可以增加菌体对脱壁酶的敏感性植物细胞一般选择活跃生长器官和组织细胞，由此制得的原生质体生活力较强，再生分化比例较高。常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶第38页，讲稿共49张，创作于星期日2、除壁酶的选择细菌放线菌用溶菌酶处理酵母菌用蜗牛酶
29、处理霉菌用几丁质酶和纤维素酶配合植物细胞一般用混合酶第39页，讲稿共49张，创作于星期日3、酶浓度酶浓度增加，原生质体的形成率也增大，酶浓度过低不利于原生质体形成，酶浓度过高则导致原生质体再生率的降低4、酶解温度20405、酶解时间酶解时间过长，原生质体再生率降低6、渗透压稳定性原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压下才能维持第40页，讲稿共49张，创作于星期日（二）原生质体融合融合是把两个亲本原生质体混合在一起，通过诱导融合作用使原生质体发生融合。1、生物学法主要用于动物细胞融合该法由于病毒的致病性和寄生性，制备比较困难，诱导产生的细胞融合率比较低，重复性不高，近年
30、不多用第41页，讲稿共49张，创作于星期日用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 第42页，讲稿共49张，创作于星期日u 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。u应用最广泛的化学融合剂聚乙二醇(PEG)u聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。2、化学融合法、化学融合法第43页，讲稿共49张，创作于星期日聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细
31、胞融合过程第44页，讲稿共49张，创作于星期日3、物理法、物理法 常用的物理法为电击法，当细胞处于电场中，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：电融合法的优点：u融合率高、重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。第45页，讲稿共49张，创作于星期日电融合的基本过程：电融合的基本过程：细胞膜的接触：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即当原生质体置于电导率很低的
32、溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。第46页，讲稿共49张，创作于星期日（三）原生质体再生原生质体失去了细胞壁，是失去了原有细胞形态的球状体，原生质体再生必须使用再生培养基，再生培养基由渗透压稳定剂和各种营养成份组成第47页，讲稿共49张，创作于星期日（四）融合子的选择融合子的选择主要依靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。第48页，讲稿共49张，创作于星期日感谢大家观看第49页，讲稿共49张，创作于星期日