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1、荧光原理及其应用第1页，此课件共57页哦 公公公公司司司司在在在在首首首首家家家家通通通通过过过过国国国国际际际际ISO14001ISO14001环环环环境境境境论论论论证证证证的的的的深深深深圳圳圳圳高高高高新新新新技技技技术术术术园园园园区区区区内内内内拥拥拥拥有有有有近近近近2000m2000m22的的的的GMPGMP标标标标准准准准生生生生产产产产厂厂厂厂房房房房，其其其其中中中中包包包包括括括括严严严严格格格格按按按按GMPGMP要要要要求求求求建建建建立立立立的的的的450m450m22的的的的洁洁洁洁净净净净车车车车间间间间及及及及其其其其他他他他辅辅辅辅助助助助车车车车间间间间
2、，是是是是目目目目前前前前国国国国内内内内第第第第一一一一家家家家通通通通过过过过体体体体外外外外诊诊诊诊断断断断试试试试剂剂剂剂GMPGMP认证的厂家。认证的厂家。认证的厂家。认证的厂家。GMPGMP标准厂房标准厂房标准厂房标准厂房（GMP-GMP-GMP-药品生产质量管理规范）药品生产质量管理规范）药品生产质量管理规范）药品生产质量管理规范）药品生产质量管理规范）药品生产质量管理规范）第2页，此课件共57页哦第3页，此课件共57页哦1.1.1.1.1.1.乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒(HBV)(HBV)(HBV)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)
3、(PCR)(PCR)荧光荧光荧光荧光荧光荧光定量定量定量定量定量定量检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒2.2.2.2.2.2.人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒（HIV-1HIV-1HIV-1）核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光荧光荧光荧光荧光荧光定量定量定量定量定量定量检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒检测试剂盒3.3.3.3.3.3.丙肝病毒丙肝病毒丙肝病毒丙肝病毒丙肝病毒丙肝病毒(HCV)(HCV)(HCV)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩
4、增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒4.4.4.4.4.4.结核杆菌结核杆菌结核杆菌结核杆菌结核杆菌结核杆菌(TB)(TB)(TB)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒5.5.5.5.5.5.沙眼衣原体和淋球菌沙眼衣原体和淋球菌沙眼衣原体和淋球菌沙眼衣原体和淋球菌沙眼衣原体和淋球菌沙眼衣原体和淋球菌(CT&NG)(CT&NG)(CT&NG)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸
5、扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光双检试剂盒荧光双检试剂盒荧光双检试剂盒荧光双检试剂盒荧光双检试剂盒荧光双检试剂盒第4页，此课件共57页哦TORCHTORCHTORCH计划中的产品计划中的产品计划中的产品计划中的产品计划中的产品计划中的产品人巨细胞病毒人巨细胞病毒人巨细胞病毒人巨细胞病毒人巨细胞病毒人巨细胞病毒(HCMV)(HCMV)(HCMV)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光定量检测试剂盒荧光定量检测试剂盒荧光定量检测试剂盒荧光定量检测试剂盒荧光定量检测试剂盒荧光定量检测试剂盒人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒人乳头
6、瘤病毒人乳头瘤病毒(HPV6/11;16/18)(HPV6/11;16/18)(HPV6/11;16/18)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒人单纯疱疹病毒人单纯疱疹病毒人单纯疱疹病毒人单纯疱疹病毒人单纯疱疹病毒人单纯疱疹病毒(HSV)(HSV)(HSV)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒弓形虫弓形虫弓形虫弓形虫弓形虫弓形虫(TOX.)(TOX.)(TO
7、X.)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒风疹风疹风疹风疹风疹风疹(RUB.)(RUB.)(RUB.)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒其他产品其他产品其他产品其他产品其他产品其他产品解脲支原体解脲支原体解脲支原体解脲支原体解脲支原体解脲支原体(UU)(UU)(UU)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检测试剂
8、盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒(HBV)YMDD(HBV)YMDD(HBV)YMDD突变核酸扩增突变核酸扩增突变核酸扩增突变核酸扩增突变核酸扩增突变核酸扩增(PCR)(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒第5页，此课件共57页哦幽门螺旋杆菌幽门螺旋杆菌幽门螺旋杆菌幽门螺旋杆菌(HP)(HP)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒肺炎支原体肺炎支原体肺炎支原体肺炎支原体(M
9、P)(MP)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒EBEB病毒病毒病毒病毒(EBV)(EBV)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒梅毒梅毒梅毒梅毒(TP)(TP)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒 -地中海贫血地中海贫血地中海贫血地中海贫血(MA)(MA)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒苯丙酮尿症苯丙酮尿症苯丙酮尿
10、症苯丙酮尿症(PKU)(PKU)核酸扩增核酸扩增核酸扩增核酸扩增(PCR)(PCR)荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒荧光检试剂盒开发研制中的新产品开发研制中的新产品第6页，此课件共57页哦新新药药试试生生产产转转正正式式生生产产批批件件乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（核酸扩增（PCR）荧光荧光定量定量检测检测 试剂盒试剂盒国药准字国药准字S20020033第7页，此课件共57页哦PCR基础基础第8页，此课件共57页哦PCR-DNA体外复制体外复制第9页，此课件共57页哦PCR信号放大信号放大第10页，此课件共57页哦PCR的特点的特点高灵敏度高特异性简便快捷第11页，此课件共5
11、7页哦荧光荧光PCRPCR检测原理检测原理第12页，此课件共57页哦荧光荧光PCRPCR？荧光标记引物、探针或荧光标记引物、探针或PCRPCR扩增产扩增产物物动态监测荧光信号变化动态监测荧光信号变化第13页，此课件共57页哦荧荧 光光 染染 料料光能光能光能光能热能热能热能热能转移给临近的分子转移给临近的分子转移给临近的分子转移给临近的分子第14页，此课件共57页哦荧光荧光信号信号 荧光染料直接结合扩增产物荧光染料直接结合扩增产物荧光染料直接结合扩增产物荧光染料直接结合扩增产物SYBR green ISYBR green ISYBR green ISYBR green I特异性结合双链，释放荧
12、光信号特异性结合双链，释放荧光信号特异性结合双链，释放荧光信号特异性结合双链，释放荧光信号 荧光标记引物荧光标记引物荧光标记引物荧光标记引物 特异性荧光探针特异性荧光探针特异性荧光探针特异性荧光探针TaqmanTaqmanTaqmanTaqman双荧光标记探针双荧光标记探针双荧光标记探针双荧光标记探针molecular Beaconmolecular Beaconmolecular Beaconmolecular Beacon荧光标记探针荧光标记探针荧光标记探针荧光标记探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针第15页，此课件共57页哦 FRET？当某个荧光基
13、团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧
14、光共基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移振能量转移振能量转移振能量转移(FRET),(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。蔽。蔽。蔽。第16页，此课件共57页哦TaqmanTaqman？特异性荧光双特异性荧光双标记探针标记探针Taq酶酶 5 533外切外切酶活性酶活性第17页，此课件共57页哦Molecular beacon？第18页，此课件共57页哦荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸
15、第19页，此课件共57页哦C C C CT T T T值值值值样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数第20页，此课件共57页哦PCRPCRPCRPCR荧光试剂标准品扩增曲线荧光试剂标准品扩增曲线荧光试剂标准品扩增曲线荧光试剂标准品扩增曲线（仪器：（仪器：（仪器：（仪器：Bio-rad iCyclerBio-rad iCyclerBio-rad iCyclerBio-rad iCycler）1x108 拷贝拷贝/ml1x107 拷贝拷贝/ml1x106 拷贝拷贝/ml1x105 拷贝拷贝/ml1x1
16、04 拷贝拷贝/ml第21页，此课件共57页哦定量原理和方法定量原理和方法原原理理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。外外标标法法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标准品进行FQ-PCR扩增，绘制荧光定量标准曲线。内标法内标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中，与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的因素，也可对样品的拷贝数加以校正。第22页，此课件共57页哦荧光荧光PCRPCR定量的原理定量的原理-外
17、标法外标法第23页，此课件共57页哦标准曲线标准曲线定量定量第24页，此课件共57页哦对数期分析与终点分析的比较对数期分析与终点分析的比较对数期分析与终点分析的比较对数期分析与终点分析的比较第25页，此课件共57页哦荧光荧光PCR重现性重现性第26页，此课件共57页哦荧光PCR特点l灵敏度高灵敏度高l特异性强特异性强l全封闭全封闭PCR过程，无需后处理过程，无需后处理l采用采用dUTPUNG酶的防污染系统，有效降低污染机会酶的防污染系统，有效降低污染机会l即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量l定量范围宽，可达到定量范围宽，可达到10个数量级，
18、无须稀释样品个数量级，无须稀释样品l可实现一管多检可实现一管多检l仪器自动分析，更快获得结果仪器自动分析，更快获得结果第27页，此课件共57页哦竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标(IC)(IC)定量定量定量定量PCRPCR技术技术技术技术第28页，此课件共57页哦竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标(IC)(IC)什么是什么是什么是什么是IC?IC?IC?IC?Internal Internal controlcontrol简简称称ICIC，通通常常是是指指与与靶靶序序列列十十分分相相似似的的一一段段DNADNA序序列列，两两者者在在相相同同的的条条件
19、件下下可可被被同同一一对对引引物物扩扩增增，具具有有相相同同的的扩扩增增效效率率；区区别别在在于于两两者者的的探探针针结结合合区区，可可分分别别被被不不同同序序列列的的探探针针识识别别，通通过过探探针针的的不不同同荧荧光光标标记记实现区分。实现区分。ICICICIC的作用的作用的作用的作用 监监控控PCRPCR反反应应，避避免免样样本本抑抑制制物物、DNADNA（RNARNA）提提取取过过程程的的丢丢失失、误误操操作作等等造造成成的的假假阴阴性性结结果果；并并对对以以上上原原因因造造成成的的定定量量误误差差进进行修正。行修正。第29页，此课件共57页哦内标工作原理图内标工作原理图内标工作原理图
20、内标工作原理图第30页，此课件共57页哦荧光荧光PCR在临床诊断上的应用在临床诊断上的应用第31页，此课件共57页哦荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用 早期诊断早期诊断早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证新药验证新药验证 输血源的筛选输血源的筛选输血源的筛选输血源的筛选母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断第32页，此课件共57页哦疾病的早
21、期诊断疾病的早期诊断免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期窗口期”，比如，比如HCVHCV的的“窗口期窗口期”平均长达平均长达7070天，不利于对疾病的天，不利于对疾病的早期诊断；早期诊断；PCRPCR方法直接检测病原体的方法直接检测病原体的DNA/RNADNA/RNA，能大大缩短，能大大缩短“窗口期窗口期”，其，其高灵敏度的检测高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断显然也有利于疾病的早期诊断。第33页，此课件共57页哦HBV
22、DNA与血清免疫学的关系HBV DNA HBV DNA 与与HBsAg/HBsAbHBsAg/HBsAb的关系的关系HBsAgHBsAg（+）HBV DNAHBV DNA（-）：病毒基因的整合，此时只能表达HBsAg，而没有DNA的复制；操作失误；PCR试剂的灵敏度不够。HBsAgHBsAg（-）HBV DNAHBV DNA（+）：“窗口期”；HBsAg 的水平过低无法检出，或者HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态；暴发性乙肝以合成HBcAg 为主，很少或不合成HBsAg；S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBV DNA阳性；血清亚型的漏检；老年人HBsAg检出率低于5%，H
23、BsAbHBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有报道HBsAb出现后血清内仍有DNA复制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb与HBV DNA同时阳性，但通常HBV DNA检出率逐步下降HBV DNA HBV DNA 与与HBeAg/HBeAbHBeAg/HBeAb的关系的关系HBeAg阳性与HBV DNA有显著相关。HBeAg 阴转往往是HBV病毒血症的消失或炎症的静息。通常认为HBeAg转阴继而出现HBe抗体的转化为乙型慢性肝炎好转稳定的标志。事实上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg阴转并不意味着炎症活动的停止。HBeAg阴性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcA
24、g的表达为主，感染起始即为HBeAg阴性。第34页，此课件共57页哦病毒感染窗口期的病毒感染窗口期的病毒感染窗口期的病毒感染窗口期的NATNAT检测检测检测检测第35页，此课件共57页哦Lam et al-Hepatol 26:226,1997对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量时提供直接证据；而荧光定量PCRPCR检测可直接反映病原体滴度检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提
25、供直接依据，是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。间提供依据。抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导第36页，此课件共57页哦如如HBVHBV：根据根据20002000年拉米夫定临床应用指导意见年拉米夫定临床应用指导意见，中国慢性乙，中国慢性乙肝病人治疗的主要目的就是降低血清肝病人治疗的主要目的就是降低血清HBV DNAHBV DNA，诱导，诱导HBeAgHBeAg血清转换等。血清转换等。HIV:HIV:目前用于治疗艾滋病的药物中主要就是抗病毒
26、类药物，目前用于治疗艾滋病的药物中主要就是抗病毒类药物，因此，因此，HIV RNAHIV RNA滴度的定量测定与抗滴度的定量测定与抗HIVHIV药物治疗及疗效药物治疗及疗效有着直接的关系。有着直接的关系。第37页，此课件共57页哦乙型肝炎患者抗病毒药物治疗前后的乙型肝炎患者抗病毒药物治疗前后的乙型肝炎患者抗病毒药物治疗前后的乙型肝炎患者抗病毒药物治疗前后的HBVHBV滴度比较滴度比较滴度比较滴度比较第38页，此课件共57页哦新药新药验证验证 任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效任何一种抗病毒药物，以
27、免疫标志物来评价其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。想。想。想。第39页，此课件共57页哦拉米夫定抑制血清拉米夫定抑制血清HBV DNA0-20-40-60-80-100治疗周数拉米夫定安慰剂血清HBV DNA;中位%变化0
28、4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52n=192n=404n=171n=359III期临床研究的综合数据第40页，此课件共57页哦病情评估和预后判断病情评估和预后判断 通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。检测对病情和预后评估均有参考意义。第41页，此课件共5
29、7页哦遗传疾病的早期诊断遗传疾病的早期诊断荧光荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。质。第42页，此课件共57页哦母婴传播的监控母婴传播的监控 荧光PCRPCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。供依据，为母婴传播的阻断等提供参
30、考。第43页，此课件共57页哦肿瘤的诊断肿瘤的诊断荧光荧光PCR的作用：的作用：可对原癌基因的突变和易位等作出检测。可对原癌基因的突变和易位等作出检测。可对原癌基因的可对原癌基因的mRNA进行定量分析。进行定量分析。有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。探索癌变发生机理的研究提供参考。探索癌变发生机理的研究提供参考。区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。第44页，此课件共57页哦结核病及性病等核酸检测意义结核病及性病等核酸检测意义病原体的检测在临床上通常采用镜检、培养等方法。镜检法操作简便，易造成假阳性结果，同时灵敏度较低。培养方
31、法要求高，耗时，不利于临床上的及时诊断和用药。荧光PCR方法具高灵敏度，速度快。不能培养PCR是唯一确诊手段（例如HPV）第45页，此课件共57页哦PCR污染及预防对策污染及预防对策 第46页，此课件共57页哦污染原因 标本间交叉污染 PCR试剂的污染 PCR扩增产物污染气溶胶污染实验室中克隆质粒的污染 第47页，此课件共57页哦污染的监测 对照试验 试剂空白对照阳性对照 阴性对照 重复性试验 第48页，此课件共57页哦PCR防污染措施实验环境的控制实验环境的控制PCR应实行严格的分区操作：前准备区；样本处理区，其中DNA和RNA的处理也应该分开；扩增区。各区专区使用，并尽量使用一次性消耗品，
32、高压消毒，实验器械和台面均应进行定期消毒等。2 2避免避免PCRPCR后处理后处理荧光PCR不同于其他的PCR方法，无须对PCR扩增产物进行任何的检测，实际就是对PCR污染的有力预防。3 3dUTPdUTP防污染系统防污染系统反应体系中常规的dNTPS中的dTTP替换为dUTP，在扩增过程中dU取代dT的位置掺入到PCR产物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，发生U的糖苷键的水解，经高温处理后DNA链断裂成碎片，从而无法成为下一轮的PCR的模板。第49页，此课件共57页哦防止污染的方法 合理的分区吸样枪 预混和分装PCR试剂 防止操作人员污染 设立适当的阳性对照和阴性对照 第50页，此课件共
33、57页哦 实验室分区设置实验室分区设置PCR前试剂准前试剂准备区备区 PCR前样本前样本处理区处理区加样区加样区PCR扩增扩增检测区检测区第51页，此课件共57页哦减少PCR循环次数，选择质量好的Eppendorf管第52页，此课件共57页哦假阳性污染的原因标本间交叉污染 PCR试剂的污染 PCR扩增产物污染气溶胶污染 实验室中克隆质粒的污染 第53页，此课件共57页哦污染的监测设立对照试验阳性对照 阴性对照：标本和试剂 对照 重复性试验选择不同区域的引物进行PCR扩增第54页，此课件共57页哦PCR假阴性的原因分析 样品处理或保存方面的问题：抗凝剂使用不当（如肝素可显著抑制PCR反应）、溶血
34、、样品反复冻融等。样品处理过程中模板的降解或丢失：操作不规范、存在核酸酶（特别是RNase）的污染等。PCR试剂已过期或保存不当：未保存在低温下，多次冻融等导致引物或/和探针的降解。存在PCR抑制物：血红素、有机试剂等。PCR反应体系方面的问题：加样不准确、错加、漏加某种试剂等。第55页，此课件共57页哦仪器和耗材方面的原因PCR仪本身的质量问题 离心机问题：离心力、离心时间Eppendorf管和塑料枪头质量或处理不当第56页，此课件共57页哦解决的对策严格按照操作规程进行样品的保存、处理以及模板的制备规范操作设立对照的原则防止核酸酶(RNase和DNase)的污染建立健全的实验室管理体系和完整实验记录第57页，此课件共57页哦