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1、 细胞冻存的方法与步骤 文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科 李晶?一、细胞冷冻保存 1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（1）传统方法:冷存管置于 410 分钟-2030 分钟-801618 小时(或隔夜)-液氮槽 vaporphase 长期储存。-2
2、0不可超过 1 小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3/分钟之速度由室温降至（-80以下）-120，再放在液氮槽 vaporphase 长期储存。适用于悬浮型细胞与 hybridoma 之保存。3、步骤：（1）冷冻前 24-48 小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至 20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，
3、取少量细胞悬浮液(约 0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO 最后浓度为 510），使细胞浓度为 15106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，12ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为 8090致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如 hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期
4、冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70 度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以 0.22micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如 SigmaD-2650)，以 510ml 小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免 DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用 10%甘油冻存。（
5、4）冷冻保存之细胞浓度：normalhumanfibroblast:13106cells/ml hybridoma:13106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些 hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻 24 小时后死去。adherenttumorlines:57106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而 HeLa 只需 13106cells/ml othersuspensions:510106cells/ml，humanlymphocyte 须至少 5106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为 5 或 10DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在
6、做冷冻保存之同时，亦应作一个 backupculture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用 10%90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍 20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4 度时），复苏存活率在 80%90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。?二、冷冻细胞活化 1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料 37恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器 4、步骤：（1）操作人员应戴防
7、护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于 37水槽中回温，回温后喷以 70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入 37水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，以 70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为 1:101:15)，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。取 0.1ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如 DMSO 或 glycerol)，依细
8、胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有 5-10ml 培养基之离心管内，离心 1000rpm，5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试 1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是 Coultercounter 粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个 chambers，每个 chamber 中细刻 9 个 1mm2大正方形，其中 4个角落之正方形再细刻 16 个小格，深度均为 0.1mm。当 chamber 上
9、方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为 1mm20.1mm=1.0 x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以 104，即为每 ml 中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为 dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之 trypanblue 染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之 Erythrosinbluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含
10、血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及 0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于 100mlCa+/Mg+freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4
11、%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取 50l 细胞悬浮液与 50ltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。（2）取少许混合液(约 15l)自血球计数盘 chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除 4，乘以稀释倍数(至少乘以 2，因与 trypanblue等体积混合)，最后乘以 104，即为每 ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4 大格细胞总数
12、稀释倍数104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm0.1cm0.01cm=10-4ml 计数板计数时，最适浓度为 510105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75monolayerculture 制成 10ml 细胞悬浮液，取 0.1ml 溶液与 0.1mltrypanblue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243 平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.751042（稀释倍数）=1.22106；细胞数/flask（10ml）：1.2210610ml=12.2106 存活率：225/24392.6%