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1、 精品文档 乙型肝炎病毒(HBV DNA PCR ABI7300)检侧标准操作程序 一、INFORMATIONFORTEST 检测信息 项目名称 乙型肝炎病毒核酸 方法 聚合酶链反应 方法依据 卫生部全国临床检验操作规程 第三版（2006）第七篇第六章第一节 二、ANALYTICALPRINCTPLE 检测原理 聚台酶链式反应(PCR可对特定核苷酸片段进行指数级的扩增，而实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，荧光物质有两
2、种：荧光探针和荧光染料。我们目前是使用TaqMan 荧光探针的检测原理：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5一 3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，荧光信号强度也等比例增加（图一）。这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。精品文档 精品文档 三、操作步骤 （一）试剂配制 1、进入试剂准
3、备区，开启冰箱冷冻层取出 HBV-DNA 检测试剂盒。查看外包装盒(包括生产批号、有效期)，无误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及 Taq 酶(核对核酸提取液、HBVPCR 反应液及 Taq 酶管上批号与试剂外包装盒批号是否一致)（图1），不一致则不可使用，需更换新的试剂。室温平衡 20min，完全融化后 2000rpm 离心备用。、核酸提取液的分装 230(开机前用紫外线消毒 1）取 0.5ml 离心管架置于超净工作台内（，用右手拿起镊子逐个将离心管放入离心管架（注意应夹住离)分钟，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为)心管外壁，不能碰到管内壁。完成)对照品+质控品样本数从上往下隔行排，离心
4、管个数为 n(n=。2 后将镊子放回原位（图）精品文档 精品文档 左(0.5m1 离心管中（2）用移液器准确吸取核酸提取液 50ul 分装至。因核酸提取液内含固体沉淀上角第一排开始，从左住右依次加入）颗粒物，为使颗粒均匀分布，故每次取样时都要用移液器反复吸打）。分装完毕后将移液器量程归位。3-4 次（图 3 ）加完一架后用右手拿镊子将离心管拿起，左手大拇指和中指夹 3（紧离心管下部，然后用食指将盖子盖上，顺序为：从右下角第一个开，离心管盖全部盖完后，通过传递窗）4 始，从右住左依次盖上（图 转移至标本处理区。精品文档 精品文档 反应液的配制、HBV-DNA3 每批需设置空白对照、阴性对照、临界
5、阳性对照（同时检测低值、阳性质控品、阳性标准阳性质控品，则无需再检测临界阳性对照质控品，每个阳性标准品+n=样本数+对照品品。所需每批需配制数 测试反应体系配制如下表：试剂 HBV PCR 反应液 酶 Taq 用量（ul）35.7 0.3 根据每日需检测标本份数计人份，试剂可检测 32 每盒（1）HBV-DNA人份需要进行酶用量（例有 111PCR 算出每批所需 HBV 反应液和TaqHBV PCR 酶加入 10ul 移液器将 Taq 盒试剂可直接使用检测，则有3 酶反应液和 Taq 人份试剂需将反应液中，另有 111-3*32=15HBV PCR。）离心管中配制（图使用移液器按反应体系比例吸
6、取至 1.5m15 精品文档 精品文档 酶，按上述要求配制反应液和 Taq（2）取出离心后备用的 HBV PCR离心，然后再用离心机 2000rpm 后用旋涡振荡器振荡混匀 5-10sec）。10sec 备用（图 6 枪 200u1 可选用空余的）从操作台面上拿取 HBV-DHA 试剂配制盒(（3至超净工作台内，打开配制盒并用记号笔在相应的孔位右旁按)头盒。编号规则为：样本扩增反应管对应的孔位按相应）顺序编号（图 7（如有高值的样本流水号编写、阳性质控品反应管对应的孔位编“Q”，临界阳性对照对应的”，低值为 HL)，阴性对照品孔位编“-则标为号标准品对应的孔位，B 孔位编“”，空白对照对应的孔
7、位编“”1 精品文档 精品文档 编“S1”，2 号标准品对应的孔位编“S2”，依此类推。使用的是八(ABI73004）编号完毕后，用右手拿起镊子夹起反应管（联一薄壁反应管，镊子应夹住反应管外壁，不可接触到内壁。按（图=n)隔列摆放到配置盒上。8）所示方向依次将所有反应管(反应管数 量程调反应液，用移液器(PCRTaq）（5 从离心机中取出已混好酶的，准确吸取反应液并按从上到下、从左至右的顺序依次加至 36ul)至反应管中，注意：吸头应深入到反应管底部，放液时应缓慢，切勿形 精品文档 精品文档。全部加样完毕后将配制盒通过传递窗转移至样本处）成气泡（图 9 理区。（二）标本处理、标本、质控品及对照
8、品的处理 1 阳性质控品、阴性对照品，室温平 HBV DNA（1）从冰箱冷冻室取出 待其完全融化。衡 20min）核对标本和原始申请单的条形码和检验项目，无误后依次粘贴（2 上相应的流水号，如ADICON P 0001 2016-01-12 、从传递窗中取出试剂准备区分装好核酸提取液的离心管架，移至2，.2、3、生物安全柜内在管盖上用记号笔写上阿拉伯数字 1，阴性对照管标 H，低值为 L)”阳性质控管标上“Q（如有高值则标为，就表 1”-，临界阳性对照管标上“，。离心管盖上标记的是上“）的标本（图示该管要加入流水号为 P000110。精品文档 精品文档 11）注意：每个离心管的编号方向都应朝向
9、管口开启的方向。（图 精品文档 精品文档 、去除标本管盖：将标本从前处理取至标本准备区，按排列顺序依 3次去除样本管上的橡胶塞。具体操作为：在生物安全柜中，左手拿起右手食指轻轻顶住橡胶血清管并固定，右手拇指和中指涅紧橡胶塞，逆时针方向轻轻旋下橡胶塞后废弃于装有消毒液的垃极塞顶部凹面，（注意：手指切勿接触到血清管口或碰触到血清，如手。桶（图 12）套上有血清则需及时跟换新的手套；待所有样本管盖都去除完毕后，)也需更换新的手套。、样本及对照品的处理：4 的移液器准确吸取样本 200u1 调至 50u1用量程为 a、左手拿起样本，注：为保证样本的均一性和吸样准确，每次取样时需用移液器将样(13 次；
10、吸样时移液器套筒不可接触到样本管内壁)（图）3-5 本吸打 精品文档 精品文档 b.吸样完毕后，将样本管放至另一试管架中(切勿不可将样本放回原试管架位)（图 14）。再用左手按前面所述样本流水号和离心管编号的对应关系拿起相 c.食指和中指固定离心管，单手操作，打开离心管盖(注：应的离心管，)拇指稍向后上方发力打开管盖，手指切勿碰到离心管口和管盖内侧。）（图 15 精品文档 精品文档 管盖完全打开后，用左手食指、拇指和中指固定离心管，将吸头中d.）次。（图 16 的样本全部打入离心管底部，轻轻吸打混匀 3-5 注：一个吸头只能用(e.加样完毕后弃枪头干盛有消毒液的垃极桶中。同时盖于一个样本的吸样
11、，禁止使用一个吸头重复吸取不同样本)放回的位置需另起一行，切不可放回原上离心管盖并放回离心管架(，继续处理下一个样本。对照品和质控品同病人样本一样处理。)位 17（图）精品文档 精品文档 f.待一架离心管全部加样完成后用振荡混匀器充分振荡混匀 10-15秒。g.左手将混匀后的离心管转移至恒温金属浴上(注：离心管需对称的放置在恒温金属浴相匹配的孔槽内)，用计时器计时，100误差不超过1干浴 10min(误差不超过30sec)。（图 18）防止离心管盖因加热爆开导干浴时用离心管架置于加热的离心管上，。19 致标本间的污染（图）精品文档 精品文档 h.十分钟后前后不超过半分钟)，右手用摄子夹起橡皮垫
12、从恒温金属浴中拿出离心管（图 20）。摆放离心I.将上述离心管按顺序对称放入低温高速离心机转子孔内，离 12,OOOrpm 管时要将离心管开口朝内，盖上转子盖及离心机盖后，（图 0.5m1 离心时需在转子孔内放置离心管专用适配器心10min(注：。）21 精品文档 精品文档 j.待离心结束后，取出离心管并按编号顺序依次摆放在离心管架上(参照（图 10）的排列方式)并 4C 冰箱保存备用；若当夭不使用，则应保存在一20C条件下，使用前置室温平衡20min，再以12,OOOrpm离心 10min。5、待全部样本加样完毕更换手套，左手用镊子夹起反应管盖的一侧的延伸段(不要碰到管盖)，然后用右手大拇指从左住右依次盖紧管盖(不要碰到其他未盖的反应管口)（如图 22）。精品文档 精品文档 6、将反应管连同试剂配置盒通过传递窗传至扩增分析区。（三）扩增分析 1、打开扩增仪专用电脑，待电脑完全启动进入操作界面后再开启定量 PCR 仪主机电源。a.b.按压托盘以打开它（图 23）。96 注：在反应管总数不足 b.将反应管按顺序纵向放置放入反应板架(两边放置要求尽可能对应对称的将反应管放置在反应板架上，个时，也可以使各反应管受力和受热都称，可以防止热盖下压时发生倾斜，）。24)比较均匀（图 精品文档 精品文档 c.按压托盘以关闭它。精品文档