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1、实验动物科学设计大纲 实验名称:C57BL/6 小鼠繁殖性能的观察研究 主题来源:可选 设计类:设计师:XXX 日期:2 指导老师:XXXX 1.实验设计的目的和意义，实验设计的目的和意义，国外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。目的:研究 C57BL/6 小鼠的繁殖性能，以提高受孕率，实现最佳配种。国外研究现状:C5BL/6 小鼠是little于 1921 年利用遗传学原理，以毛色基因为标记培育的近交小鼠。BL/6 纯系小鼠性成熟早，36 日龄雄性附睾精液中有活动精子。雌性小鼠在 37 日龄时可以排卵和受孕。正常情况下，雌鼠每 4 5 天有一个性周期，发情后 2 3 小时可排卵。妊娠期 1
2、9 21 天，哺乳期 20 22 天。雌鼠分娩后也可有发情期，即分娩后 24 小时排卵。此时交配可使其怀孕，俗称“血交配”，有边喂边怀孕的现象。现有的研究表明，在各种繁殖实验中，交配季节非常重要，一般应在春秋两季进行。因为老鼠怕热怕冷，这个季节温度适宜，所以动物受孕率高。在夏季和冬季，动物房的室温应控制在(222)。结果表明，温度、光照、噪音、湿度、营养等因素对小鼠性周期有较大影响。当温度低于 10时，C BL/6 纯系小鼠的受孕率极低，胚胎获取往往失败。光照、温度、噪音、湿度、营养等因素对小鼠的性周期影响很大。当噪音高于 80 分贝时，老鼠躁动不安，打架撕咬，几乎没有交配现象；当空气相对湿度
3、低于 30%时，小鼠脱毛现象严重，同时雌鼠受胎率和产仔数降低。目前提高产仔成活率的方法主要有“预接触”和“超数排卵”两种。“预接触”:交配前两天，将 1 只雄性大鼠放入 5cm5cm5em的封闭围栏筐内，筐内放置 8 只雌性大鼠的鼠笼。雌鼠和雄鼠这样生活 2 天，第三天晚上把雄鼠放出来，雌雄交配。“超数排卵”:使用孕马血清促性腺激素(PMSG)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)。中午 12:00 雌性小鼠腹腔注射PMSG 10U，48 小时后腹腔注射HCG10U，当晚 800 将小鼠 1:1 关笼。我们通常将裸鼠的裸基因(nu)导入C57 BL小鼠进行杂交、杂交、回交，获得大量裸鼠。但其繁殖力低
4、，给实验动物的研究带来了很大困难。存在的问题:不能很好地把握小鼠性周期四个阶段的特点，不能很好地确认性周期的发情阶段，对实验结果的判断有一定的影响。但其繁殖率低，给实验动物的研究带来困难。解决问题的思路是通过产仔成活率判断其繁殖性能，通过阴道涂片和阴道检查判断其发情情况，可用于指导其动物交配和观察产仔存活数，并用统计学方法分析实验结果。参考 1郝光荣。实验动物科学。:第二军医大学，1999.93 2官原次郎(原文)，郗超等译。哺乳动物发育工程的实验方法。:大学 1992.71 77。3袁伯钧，王，.军事医学新药L临床前安全性评价与实践 科学，1997 4仪，钟欣，邱黎明。低湿度对实验小鼠生殖的
5、影响。赣南 医学院学报，2003，3:358。5方婧。动物实验方法论。:人民健康，2001.174。C57 BL/6 小鼠生产能力的观察研究 张謇、吴献金、马兰、胡浩、全清丽.(1.怀化大学生物技术系，云南怀化，418008(2、云南大学单克隆抗体技术中心，昆明，650091 摘要:为提高受精率，对C57 BL/6 小鼠的生产能力进行了研究 表明在性周期中表征estms是重要的。自然获得的合子的质量 二、实验设计方案(实验设计目标、要解决的主要问题、实验动物设计、实验专业设计、实验统计设计、实验方法设计、可行性分析、预期结果、实验设计工作安排)(一)实验设计目标，需要解决的关键问题 目的:研究
6、 C57BL/6 小鼠的繁殖性能，找出影响受孕率的主要因素，以指导其繁殖，提高产仔成活率。要解决的关键问题:如何把握小鼠性周期的特点，准确确认性周期的发情期。(2)实验设计 1.实验动物设计(遗传背景、微生物质量、育种、饲养管理、动物模型、实验动物科学技术)1.1 遗传背景:1921 年，Little 用 Abby Lathrop 小鼠品系通过近亲交配繁殖了几只近交动物，起源是 57 号雌鼠与 52 号雄鼠交配，命名为 c c，固定为巧克力色的中等毛色称为 C BR；毛色固定为黑色的人称为 c BL，其子系统有 C BL/6、C 7BL/6J、C 57BL/6N 等。C57BL/6对 Graf
7、tfi 白细胞因子敏感，肿瘤自发率约60%，细胞免疫随年龄增长而下降，繁殖率低。1.2 微生物质量:清洁级(CLA)C57BL/6 小鼠，雌雄不限。1.3c57bl/6 小鼠的繁殖和繁殖 1.3.1 育种方法:近亲繁殖，1.3.2 初始动物的选择:选择一对或几对具有育种目标所需性状的同胞。1.3.3 性别识别:1.雄性大鼠的生殖器离肛门很远。2.雄鼠生殖器和肛门之间的长毛。3.雄鼠的生殖器比雌鼠的大。4.雌鼠的乳头比雄鼠明显。1.3.4 性成熟:35-55 日龄；年龄:60 天左右；成熟时的重量:超过 20 克 1.3.5 发情鉴定:看雌鼠的外阴和阴道口。当外阴肿胀，阴道口张开且干燥时，可确认
8、为发情期母鼠。同时可以通过阴道涂片观察。涂片上有大量角化上皮细胞和少量有核上皮细胞，细胞散在分布，不聚成堆，为发情雌鼠。1.3.6 交配:发情前期交配。1.3.7 交配形式:近亲交配(全同胞交配)1.3.8 妊娠诊断:胎儿触诊、阴道涂片、外涂片、直肠检查。1.3.9 繁殖代数:所有作为亲本的同胞(初始动物)记为 0 代，雌雄 1:1 交配，后代记为 1 代，从所有同胞中选出一对或多对满意的作为亲本，雌雄 1:1 交配，以此类推，直至 20 代以上。1.3.10 个体选择:选择保持力和繁殖力强、生命力强、目标形态优良的个体。1.3.11 保种方法:修改平行线系统。1.3.12 扩大再生产方法:交
9、通信号法。1.4 饲养管理:C57BL/6 小鼠应在开放式系统动物房中饲养。由于光照能刺激小鼠性激素的分泌，对雌性小鼠的性周期有一定的影响，所以采用 12h:12h 光暗光照，使用无毒塑料笼。被褥材料选用吸湿性好、无毒、无味、粉尘少的材料，如电刨花等。一般来说，所有的笼子，垫料，饲料和饮用水都要消毒。温度控制在 20-25，鼠房相对湿度保持在 45%-60%，噪音保持在 60dB 以下。一年四季都要进行通风。喂食时，应使用特殊的老鼠饲料。高脂牛奶可以添加到粉状饲料中。当饲料中含有 4%-8%的粗脂肪时，C57BL/6 小鼠可以获得较好的繁殖效果，对维生素也有较高的要求。2.实验专业设计 通过研
10、究光照、温度、噪音、湿度、营养等因素对小鼠性周期的影响，采用自然交配法和超数排卵法，确定最佳条件，提高受胎率，增加产仔成活率。3.实验的统计设计。采用平均值(x)标准差(s)，两组间比较采用 T 检验，组间比较采用方差分析，结果采用统计软件进行分析。4.实验动物设计方法:5.实验技术和方法:5.1.C57BL/6 纯系小鼠的选择:选择性成熟未交配的小鼠。母熊 60-70 天，体重 20-25 克。公熊 60-70 天，体重 20-30 克。5.2.确定小鼠性周期的发情期:选择适龄的雌雄小鼠，交配前检查雌鼠的外阴和阴道口。当外阴肿胀，阴道口张开且干燥时，可确认为发情雌鼠。同时可以通过阴道涂片观察
11、。涂片上有大量角化上皮细胞和少量有核上皮细胞，细胞散在分布，不聚成堆，为发情雌鼠。通过观察阴道涂片的细胞学变化和阴道口的变化，可以确定发情的不同阶段。5.3.动物交配及孕鼠检查:将已确定发情的雌性大鼠分为实验组和对照组。实验组采用自然交配法，按雌雄 1:1 的比例于晚上 8 点关笼，次日早晨检查阴道涂片和阴道栓剂。对照组采用超数排卵法，配种孕马血清促性腺激素(PMSG)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)。中午 12:00 雌性小鼠腹腔注射PMSG 10U，48 小时后腹腔注射HCG10U。他们晚上 8 点和公老鼠 1:1 关在一起。阴道涂片检查:如果镜检发现精子，则为阳性，记录为妊娠 0.5d。
12、阴道栓的检查:检查雌鼠是否有阴道栓，必要时用眼钳插入阴道，打开阴道口，看是否有阴道栓。有阴道栓剂的确定怀孕。记录为怀孕 0.5d。5.4.动物交配与妊娠的鉴别:小鼠交配后，雌鼠阴道口内形成白色阴道栓，呈“Y”形，表面有细横纹，“分叉”段连接阴道深部。一般小鼠雌栓在交配后 12 24h自动脱落。尹畅栓的有无被视为判断是否交配的重要标志。鉴别小鼠是否怀孕，可以通过观察C、BL/6 小鼠发情周期是否消失，观察阴道粘膜颜色、粘液性质、阴道口径变化等来判断。5.5.统计:大约 19-21 天后，会有婴儿出生，观察并统计他们的数量。(3)可行性分析:3.1 本实验操作简单，实验指标易于观察。3.2 小鼠容
13、易获得和饲养。(四)预期效果:在适宜的实验环境下，实验组小鼠的受孕率和出生率较高。(5)实验设计工作时间表:实验项目 工作时间表 老鼠 实验组(自然交配)控制组(超数排卵交配)观察产仔数 观察产仔数 实验小鼠的选择 30 分钟 确定小鼠的发情周期。20min 小鼠交配和妊娠试验 12 小时 小鼠的妊娠和繁殖 19-21d 三。完成实验的条件 1.仪器设备:棉签、载玻片、眼科镊子。2.实验动物来源:C57BL/6 小鼠，雄性 200 只，雌性 200 只，体重 20-30g，年龄 60-70 天。25 元 C57BL/6 小鼠购自大学华西医学中心。3.药物试剂来源:生理盐水、甲苯胺蓝。教研室评估意见 1、实验设计是否合理，能否达到预期目标？2、设计和技术路线安排是否合适？3、实验条件具备吗？实验教研室 年日