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1、第五章第五章 体内药物分析体内药物分析生物样品特点生物样品特点1 1 1 1、被测定的药物和代谢物的浓度低；、被测定的药物和代谢物的浓度低；、被测定的药物和代谢物的浓度低；、被测定的药物和代谢物的浓度低；2 2 2 2、样品大多需要分离和净化；、样品大多需要分离和净化；、样品大多需要分离和净化；、样品大多需要分离和净化；3 3 3 3、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同的样品。的样品。的样品。的样品。4 4 4 4、工作量较大，、工作量较大，、工作量较大，
2、、工作量较大，5 5 5 5、要求很快地提供结果、要求很快地提供结果、要求很快地提供结果、要求很快地提供结果(毒物检测毒物检测毒物检测毒物检测)样品制备：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集（液液萃取、固相萃取等）；样品测定：光谱分析法、色谱分析法、免疫分析法、生物学方法方法验证：特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度、稳定性、提取回收率体内药物分析：体内药物分析：第一节、常用体内样品的制备与贮藏一、体内样品的种类、采集与制备一、体内样品的种类、采集与制备（一）血样：血浆、血清（一）血样：血浆、血清n n血浆：选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在体内的状血浆：选用最多。因
3、血浆中的药浓可反映药物在体内的状况。而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。血况。而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。心后分取，量约为全血的一半。血清的制备：血清的制备：血清的制备：血清的制备：采集的静脉血液置试管中，于采集的静脉血液置试管中，于3737或室温或室温放置放置30min30min 1h1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在剥去试管壁上的血饼，再在25002500 3000 r/min
4、3000 r/min离心离心5 5 10min10min，上层淡黄色液体即为血清。，上层淡黄色液体即为血清。现文献所指血药浓度为血浆或血清中药物总浓度（游现文献所指血药浓度为血浆或血清中药物总浓度（游离的和血浆蛋白结合的总浓度）。离的和血浆蛋白结合的总浓度）。血浆与血清的区别血浆与血清的区别血浆与血清的区别血浆与血清的区别 uu血清比血浆只是少一种纤维蛋白原血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 uu一般血浆中药物浓度与血清中药物浓度相当一般血浆中药物浓度与血清中药物浓度相当uu血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%60%50%60%（血清为全血的（血清
5、为全血的50%50%左右），多数用血浆进行左右），多数用血浆进行分析。分析。uu若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品使用血清样品 。（二）尿样：（二）尿样：n n尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排出。尿样常物及其缀合物形式排出。尿样常需加入防腐
6、剂需加入防腐剂。（三）、唾液：（三）、唾液：（三）、唾液：（三）、唾液：唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关。样品易得，唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推定血浆中游离药物浓度。定血浆中游离药物浓度。唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要的唾液腺分泌唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要的唾液腺分泌汇集而成前两者分泌量占总量汇集而成前两者分泌量占总量90%90%。两者中浓度大致相当。两者中浓度大致相当。取样：在潄口后取样：在潄口后15min15min，安静状态下采集口腔内然流，安静状态下采集口腔
7、内然流出的唾液；也可在刺激下快速采样出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰需注意干扰)。如口。如口嚼石腊片或将柠檬酸、维生素嚼石腊片或将柠檬酸、维生素C C等置于舌尖，弃去初始部等置于舌尖，弃去初始部分后采集。刺激后采集的为混合唾液。分后采集。刺激后采集的为混合唾液。药物在脏器组织中的分布情况，常用胃、肝、肾、药物在脏器组织中的分布情况，常用胃、肝、肾、肺、心等。肺、心等。制备：测定之前一般需制成匀浆制备：测定之前一般需制成匀浆组织样品的处理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水组织样品的处理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法解法 （蛋白水解酶）（蛋白水解酶）（四）组织：（四）组织：头发样品的采集：头
8、发样品的采集：采集枕部发样采集枕部发样(带根部），微量元素在前带根部），微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高。额部位的头发中含量最低，枕部含量最高。头发样品的洗涤：头发样品的洗涤：除去外源性污染物，推荐使用丙酮除去外源性污染物，推荐使用丙酮-水水-丙丙酮；丙酮浸泡搅拌酮；丙酮浸泡搅拌10min10min，自来水漂洗，自来水漂洗3 3次，再用丙酮浸泡次，再用丙酮浸泡搅拌，自来水、蒸馏水各洗搅拌，自来水、蒸馏水各洗3 3次。次。头发样品的处理：头发样品的处理：直接甲醇提取、酸水解、碱水解、酶水解直接甲醇提取、酸水解、碱水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶）（葡萄糖醛酸酶）分析方法与样品处理步骤的
9、选择第二节、体内样品的的前处理一、体内样品预处理的目的一、体内样品预处理的目的一、体内样品预处理的目的一、体内样品预处理的目的 1 1、使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的、使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总浓度。总浓度。2 2、介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物、介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物质、富集待测药毒物质、富集待测药毒物 3 3、为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度、为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度 4 4、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测准确度、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测准确度、精密度和选择性等。精密度和选择
10、性等。（一）、去除蛋白质（一）、去除蛋白质 是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。最先处理步骤。1 1、加入可与水混溶的有机溶剂、加入可与水混溶的有机溶剂（体积比、（体积比、pHpH值）值）破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、甲醇、破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、甲醇、乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，将混合物超乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，将混合物超速离心，取上清液作为样品。速离心，取上清液作为样品。2 2、加入中性盐、加入中性盐 使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常
11、用3 3、加入强酸、加入强酸 与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、高氯酸、与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用本法去蛋白。偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用本法去蛋白。4 4、热凝固法、热凝固法 加热至加热至9090蛋白热变性后离心或过滤除去蛋白热变性后离心或过滤除去 （二）分离、纯化与浓集（二）分离、纯化与浓集 当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。1 1、液相萃取法、液相萃取法溶剂选择溶剂选择合适的溶剂是成功的主要条
12、件合适的溶剂是成功的主要条件 了解药物与溶剂的化学结构及其性质了解药物与溶剂的化学结构及其性质 对药物未电离分子可溶，对电离形式分子不溶对药物未电离分子可溶，对电离形式分子不溶 沸点低、易挥发，毒性小与水不相混溶沸点低、易挥发，毒性小与水不相混溶 不影响紫外检测不影响紫外检测 具有较高的化学稳定性和惰性具有较高的化学稳定性和惰性 不易乳化不易乳化提取溶剂：提取溶剂：极性相似相溶极性相似相溶溶剂的用量：溶剂的用量：一般有机相与水相之比为一般有机相与水相之比为1 1：1515：1 1溶液的溶液的pHpH调节：调节：最佳最佳pHpH选择主要与药物的选择主要与药物的pKapKa值有关。酸性值有关。酸性
13、药物药物pHpH应低于药物应低于药物pKapKa值值1212个单位；碱性药物：个单位；碱性药物：pHpH应高应高于药物于药物pKapKa值值1212个单位。个单位。提取：提取：进行一次（至多二次）提取，进行一次（至多二次）提取，浓集浓集：常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易被萃取出来。空白血清在pH2、pH7和pH13三种缓冲液中用乙醚提取，提取液HPLC(220nm)测定，在pH13下提取液中杂质峰最少。液液萃取特点：液液萃取特点：优点：可将大部分内源性杂质去除；经
14、济实用、优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、可使样品富集、可一次进行多个样品萃取可使样品富集、可一次进行多个样品萃取 缺点：乳化、污染环境、缺点：乳化、污染环境、乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速冷冻破坏乳化层后融化离心冷冻破坏乳化层后融化离心。28固相萃取的模式及原理固相萃取的模式及原理反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取 阴离子交换 阳离子交换实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤 第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用
15、水或适当的缓冲液冲洗小柱第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 除去大部分甲醇除去大部分甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析干溶剂，备用或直接进行在线分析 血浆样品可直接上柱，样品量血浆样品可直接上柱，样品量0.12ml0.12ml，流速，流速12ml/min12ml/min32 本法特点：少溶剂、少污染、减少液液
16、萃取的乳化。本法特点：少溶剂、少污染、减少液液萃取的乳化。适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制成水液方可进行固相萃取。成水液方可进行固相萃取。固相萃取特别适用于极性较大、水溶性较大、稳定固相萃取特别适用于极性较大、水溶性较大、稳定性较差、不宜用过强的酸碱处理的药物。性较差、不宜用过强的酸碱处理的药物。柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进流动相系统，
17、从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。入分析柱的技术。用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是柱切换技术。柱切换技术。基本原理基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱上完成色谱分析上完成色谱分析。自动化固相萃取-柱切换高效液相色谱法 3.3.超滤法超滤法n n膜分离技术，
18、可用于测定生物样品中游离药物浓度膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药物浓度n n按照分子截留量的大小，可分离按照分子截留量的大小，可分离3030 1000kD1000kD的可溶性的可溶性生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。（三）、辍合物的水解：（三）、辍合物的水解：n n酸水解法：强酸、加热酸水解法：强酸、加热n n酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.55.5 pH4.55.5，3737孵育数小时。孵育数小时。n n溶剂解：溶剂解：（四）、化学衍生化（四）、化学衍生化1 1、使药物变成能被分析的性质、使药物变成能被分
19、析的性质2 2、提高检测灵敏度、提高检测灵敏度3 3、增强药物稳定性、增强药物稳定性4 4、提高对光学异构体分离的能力、提高对光学异构体分离的能力气相色谱衍生化气相色谱衍生化液相色谱衍生化液相色谱衍生化衍生化方法：衍生化方法：柱前衍生，柱前衍生，柱后衍生柱后衍生气相色谱衍生化方法：气相色谱衍生化方法：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化液相色谱衍生化方法：液相色谱衍生化方法：紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性衍生化化、手性衍生化 第三节、体内样品分析方法与方法验证第三节、体内样品分析方法与方法验证一、分析方法的建立一、分
20、析方法的建立（一）、分析方法的选择（一）、分析方法的选择1 1、色谱分析法、色谱分析法2 2、免疫分析法、免疫分析法3 3、生物学方法、生物学方法分析方法分析方法检测限度检测限度/10-8g/ml特异性特异性/分离能力分离能力紫外分光光度法（紫外分光光度法（UV）100荧荧光分光光度法（光分光光度法（Fluor）0.1原子吸收分光光度法（原子吸收分光光度法（AA）0.1+气气相相色色谱谱法法氢氢火焰离子化火焰离子化检测检测器（器（FID110+氮磷氮磷检测检测器（器（N-PD）0.10.01+电电子捕子捕获检测获检测器（器（ECD）0.01+质谱检测质谱检测（MS）0.001+液液相相色色谱谱
21、法法紫外紫外检测检测器（器（UV）100+荧荧光光检测检测器（器（Fluor）0.1+电电化学化学检测检测器（器（ECD）0.01-0.001+质谱检测质谱检测（MS）0.001+免疫法免疫法 0.001+常用分析方法常用分析方法（二）、分析方法建立的一般程序（二）、分析方法建立的一般程序1 1、色色谱谱条条件件的的筛筛选选：确确定定最最佳佳分分析析检检测测条条件件；色色谱谱柱柱(型型号号、牌牌号号、填填料料性性质质、柱柱长长度度)；流流动动相相组组分分及及配配比比、流流速速、柱柱温温、进进样样量量、内内标标物物质质的的浓浓度度及及其其加加入入量量等等；使使各各物物质质具具有有足足够够的的方方
22、法法灵灵敏敏度度(LOQLOQ)；良良好好的的色色谱谱参参数数(n n、R R、T T)和和适适当当的的保保留时间留时间(t tR R)。2 2、色谱条件的优化：、色谱条件的优化：在在进进行行分分离离条条件件筛筛选选时时，应应考考察察生生物物基基质质中中的的内内源源性性物物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验 溶剂溶剂(方法特异性方法特异性方法特异性方法特异性)空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质试验 内源性物质干扰内源性物质干扰(方法特异性方法特异性方法特异性方法特异性)模
23、拟生物样品试验模拟生物样品试验模拟生物样品试验模拟生物样品试验 方法验证（效能指标）方法验证（效能指标）方法验证（效能指标）方法验证（效能指标）3 3、实际生物样品测试、实际生物样品测试二、分析方法的验证1 1特异性特异性特异性特异性避免干扰避免干扰避免干扰避免干扰2 2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围3 3定量限定量限定量限定量限灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度4 4精密度与准确度精密度与准确度精密度与准确度精密度与准确度结果可重现结果可重现结果可重现结果可重现5 5样品稳定性样品稳定性样品稳定性样品稳定性 6 6提取回收率提取回收率提取回收率提取回收率7 7
24、分析过程的质量控制分析过程的质量控制分析过程的质量控制分析过程的质量控制 准确度准确度准确度准确度精密度精密度精密度精密度专属性专属性专属性专属性检测限检测限检测限检测限定量限定量限定量限定量限线性线性线性线性范围范围范围范围耐用性耐用性耐用性耐用性体外药物分析体外药物分析（一）、方法特异性(专属性或选择性)方法的特异性方法的特异性方法的特异性方法的特异性(specificity)specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)selectivity)互用互用系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力系指当有内源性物质
25、存在时，方法准确测定待测物质的能力系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性专属性表示所检测的表示所检测的信号信号信号信号(响应响应)系属于系属于待测药物所特有待测药物所特有待测药物所特有待测药物所特有的的选选择择性性系系指指将将待待测测物物质质与与其其代代谢谢物物及及同同服服的的其其它它药药物物加加以以区区区区分分分分(分离分离分离分离)的能力的能力的能力的能力考考察察一一个个分分析析方方法法是是否否具具有有特特异异性性，应应着着重重考考虑虑以以下下几几点点：1.1.1.1.内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质的的的的干
26、干干干扰扰扰扰比比比比较较较较待待待待测测测测药药药药物物物物或或或或其其其其活活活活性性性性代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物检检检检测测测测信信信信号号号号；2.2.2.2.代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物的的的的干干干干扰扰扰扰比比比比较较较较模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样样样样品品品品和和和和用用用用药药药药后后后后的的的的实实实实际际际际生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的检检检检测测测测信信信信号号号号；3.3.3.3.伍伍伍伍用用用用药药药药物物物物的的的的干干干干扰扰扰扰还还还还要要要要考考考考虑虑虑虑患患患患者者者者可可可可能能能能同同同同时时时时服服服服用用用用药药药
27、药物物物物(通通通通常常常常为为为为数数数数有有有有限限限限)的的的的干干干干扰扰扰扰。提提提提供供供供多多多多张张张张色色色色谱谱谱谱图图图图，空空空空白白白白生生生生物物物物样样样样品品品品图图图图、空空空空白白白白加加加加对对对对照、实际生物样品图；照、实际生物样品图；照、实际生物样品图；照、实际生物样品图；4.4.4.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性与参比方法的相关性与参比方法的相关性（二）、标准曲线与线性范围（二）、标准曲线与线性范围标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线（standard standard curvecurve）：应应该该使使用用至至少少6 6 个个校校正正浓浓度
28、度水水平平，不不包包括括空空白白样样品品（不不含含分分析析物物和和内内标标的的处处理理过过的的基基质质样样品品）和和零零浓浓度度样样品品（含含内内标标的的处处理理过过的的基基质质），测测定定药药药药物物物物浓浓浓浓度与响应的度与响应的度与响应的度与响应的相关性相关性相关性相关性除除少少数数方方法法（免免疫疫分分析析法法）外外，标标准准曲曲线线通通常常为为线线性性模模式，最小二乘法或加权最小二乘法回归。式，最小二乘法或加权最小二乘法回归。线性范围：线性范围：标准曲线的最高标准曲线的最高CmaxCmax与最低浓度与最低浓度Cmax/20Cmax/20的区间的区间标准曲线要求标准曲线要求标标准准曲曲
29、线线用用模模拟拟生生物物样样品品（与与待待测测的的含含药药生生物物样样品品相相同同的的生物基质）生物基质）建立建立线线性性范范围围(不不包包括括零零点点)应应能能覆覆盖盖全全部部生生物物样样品品的的药药物物浓浓度度不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度求算未知生物样品中的药物浓度 标准曲线的绘制标准曲线的绘制以以待待测测药药物物的的检检测测响响应应(如如色色谱谱峰峰面面积积或或峰峰高高)或或与与内内标标物物质质的的检检测测响响应应的的比比值值(内内标标法法)()(因因变变量量，y y )对对模模拟拟血血药药浓度浓度 (自变量，自变量，x x)求求得得回回归归方方程程(
30、y ya ab bx x)及及其其相相关关系系数数，()0.99(0.99(色谱法色谱法)或或 0.98(0.98(生物学方法生物学方法)要要求求最最低低浓浓度度点点的的偏偏差差在在20%20%以以内内、其其余余各各浓浓度度点点的的偏差在偏差在15%15%以内。以内。（三）、定量下限（三）、定量下限系系系系指指指指在在在在保保保保证证证证具具具具有有有有一一一一定定定定可可可可靠靠靠靠性性性性(准准准准确确确确度度度度与与与与精精精精密密密密度度度度符符符符合合合合要要要要求求求求)的的的的前前前前提提提提下下下下，能能能能测测测测定定定定出出出出生生生生物物物物样样样样品品品品中中中中药药药
31、药物物物物的的的的最最最最低低低低浓浓浓浓度度度度，又又又又称为方法灵敏度称为方法灵敏度称为方法灵敏度称为方法灵敏度标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点最低浓度点最低浓度点最低浓度点 LOQLOQ)要要要要求求求求应应应应能能能能满满满满足足足足测测测测定定定定3 35 5个个个个消消消消除除除除半半半半衰衰衰衰期期期期后后后后生生生生物物物物样样样样品品品品中中中中的药物浓度；准确度在的药物浓度；准确度在的药物浓度；准确度在的药物浓度；准确度在80%80%120%120%；RSDRSD20%20%（四）、精密度与准确度（四）、精
32、密度与准确度方法准确度方法准确度方法准确度方法准确度系系系系指指指指用用用用该该该该方方方方法法法法测测测测得得得得的的的的生生生生物物物物样样样样品品品品中中中中待待待待测测测测药药药药物物物物的的的的浓浓浓浓度度度度与其真实浓度的接近程度与其真实浓度的接近程度与其真实浓度的接近程度与其真实浓度的接近程度应应应应使使使使用用用用实实实实际际际际生生生生物物物物样样样样品品品品测测测测定定定定，但但但但实实实实际际际际生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的浓浓浓浓度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定度是未知的
33、，所以通常使用模拟生物样品测定一般用一般用一般用一般用相对回收率相对回收率相对回收率相对回收率表示表示表示表示测定：测定：测定：测定：取取取取高高高高(上上上上限限限限75%75%左左左左右右右右)、中中中中、低低低低（定定定定量量量量下下下下限限限限的的的的3 3倍倍倍倍以以以以内内内内）、定定定定量量量量限限限限4 4个个个个浓浓浓浓度度度度，每每每每一一一一浓浓浓浓度度度度至至至至少少少少5 5个个个个样样样样本本本本，与与与与随随随随行行行行的的的的标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线同法测定、计算方法回收率同法测定、计算方法回收率同法测定、计算方法回收率同法测定、计算方法回收率 限度要求
34、：限度要求：限度要求：限度要求：相对回收率应在相对回收率应在相对回收率应在相对回收率应在85%85%115%(115%(LOQLOQ附近附近附近附近80%80%120%)120%)RERE在在在在15%(15%(LOQLOQ附近为附近为附近为附近为20%)20%)方法精密度方法精密度方法精密度方法精密度(precision)(precision)系系系系指指指指每每每每次次次次测测测测定定定定结结结结果果果果与与与与多多多多次次次次测测测测定定定定的的的的平平平平均均均均值值值值的的的的偏偏偏偏离离离离程程程程度度度度，表表表表示示示示分分分分析方法的析方法的析方法的析方法的可重复性，可重复性
35、，可重复性，可重复性，是方法验证的基本要点。是方法验证的基本要点。是方法验证的基本要点。是方法验证的基本要点。实实实实际际际际生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的量量量量有有有有限限限限(如如如如血血血血浆浆浆浆一一一一般般般般为为为为0.50.52ml)2ml)，使使使使用用用用模模模模拟拟拟拟生物样品测定生物样品测定生物样品测定生物样品测定 。测定法测定法照照照照准准准准确确确确度度度度项项项项下下下下方方方方法法法法，取取取取空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质质质质(如如如如血血血血浆浆浆浆)数数数数份份份份，分分分分别别别别在在在在同同同同一一一一批批批批内内内内和和和和不
36、不不不同同同同批批批批间间间间制制制制备备备备高高高高、中中中中、低低低低 、定定定定量量量量限限限限4 4个个个个浓度的浓度的浓度的浓度的QCQC样品，并分析测定样品，并分析测定样品，并分析测定样品，并分析测定批内批内批内批内RSDRSD每每每每一一一一浓浓浓浓度度度度5 5个个个个样样样样品品品品，每每每每个个个个样样样样品品品品测测测测定定定定1 1次次次次，用用用用随随随随行行行行标标标标准准准准曲线分别计算曲线分别计算曲线分别计算曲线分别计算3 3个浓度及个浓度及个浓度及个浓度及RSDRSD 批间批间批间批间RSDRSD 每每每每1 1分分分分析析析析批批批批内内内内每每每每一一一一
37、浓浓浓浓度度度度制制制制备备备备1 1个个个个样样样样品品品品，每每每每个个个个样样样样品品品品测测测测定定定定1 1次次次次；在在在在不不不不同同同同天天天天连连连连续续续续制制制制备备备备并并并并测测测测定定定定3 3 个个个个合合合合格格格格的的的的分分分分析析析析批批批批。实实实实验验验验包包包包括括括括批批批批内内内内精精精精密密密密度度度度及及及及批批批批间间间间精精精精密密密密度度度度。批批批批间间间间精精精精密密密密度度度度通通通通过过过过至至至至少少少少3 3 个个个个分析批，且至少两天进行。分析批，且至少两天进行。分析批，且至少两天进行。分析批，且至少两天进行。限度要求限度
38、要求在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中对对对对 g/mlg/ml级水平的级水平的级水平的级水平的RSDRSD一般应一般应一般应一般应 10%10%ng/mlng/ml级水平的级水平的级水平的级水平的RSDRSD一般应一般应一般应一般应 15%15%在在在在LOQ LOQ 附近附近附近附近RSDRSD应应应应 20%20%。分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性；从冰箱储存条件到室温或样品处理温度，基质中分析物的冷冻和融化稳定性；基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性；处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳
39、定性；处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性。（五）、样品稳定性（五）、样品稳定性（六）、提取回收率（六）、提取回收率 萃取回收率与相对回收率的意义不同萃取回收率与相对回收率的意义不同 萃萃取取回回收收率率考考察察生生物物样样品品预预处处理理过过程程造造成的药物的损失程度成的药物的损失程度取取取取空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质质质质(如如如如血血血血浆浆浆浆)，照照照照准准准准确确确确度度度度项项项项下下下下方方方方法法法法，制制制制备备备备高高高高、中中中中、低低低低3 3个个个个浓浓浓浓度度度度的的的的QCQC样样样样品品品品(每每每每一一一一浓浓浓浓度度度度至至至至少少少少5
40、 5个个个个样样样样品品品品)，每每每每个个个个样样样样品分析测定品分析测定品分析测定品分析测定1 1次次次次另另另另取取取取等等等等量量量量的的的的相相相相同同同同3 3个个个个浓浓浓浓度度度度的的的的标标标标准准准准溶溶溶溶液液液液，用用用用溶溶溶溶解解解解模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定A AT T经萃取后的经萃取后的经萃取后的经萃取后的QCQC样品的检测信号样品的检测信号样品的检测信号样品
41、的检测信号A AS S未经萃取的标准溶液的检测信号未经萃取的标准溶液的检测信号未经萃取的标准溶液的检测信号未经萃取的标准溶液的检测信号限度要求萃取回收率一般应萃取回收率一般应萃取回收率一般应萃取回收率一般应 60%60%高、中浓度的高、中浓度的高、中浓度的高、中浓度的RSDRSD应应应应 15%15%低浓度的低浓度的低浓度的低浓度的RSDRSD应应应应 20%20%。（七）、分析过程的质量控制（七）、分析过程的质量控制 方法考察完毕后作实际生物样品的测定，用空白生物介质方法考察完毕后作实际生物样品的测定，用空白生物介质加入待测药物对照品配制已知浓度样品，考察方法稳定性，加入待测药物对照品配制已
42、知浓度样品，考察方法稳定性，推荐由独立的人员配制不同浓度的推荐由独立的人员配制不同浓度的QCQC样品对分析方法进行样品对分析方法进行质量监控。质量监控。每天建立标准曲线用于计算当天测定药物浓度，并随行测每天建立标准曲线用于计算当天测定药物浓度，并随行测定高、中、低定高、中、低3 3个浓度的个浓度的QCQC样品。样品。（八）、未知生物样品浓度超出定量范围的处理（八）、未知生物样品浓度超出定量范围的处理 1 1、浓度高于标准曲线上限：分取部分样品用相应的空白生、浓度高于标准曲线上限：分取部分样品用相应的空白生物介质稀释至方法可测浓度范围后重新测定。物介质稀释至方法可测浓度范围后重新测定。2 2、浓
43、度低于定量限：可增加未知样品的体积，但应在相、浓度低于定量限：可增加未知样品的体积，但应在相同的条件下制备同的条件下制备QCQC样品，验证方法的特异性、准确度、精样品，验证方法的特异性、准确度、精密度。在药代测定时刻不必处理，达峰前以密度。在药代测定时刻不必处理，达峰前以0 0计，达峰后以计，达峰后以无法定量（无法定量（not detectablenot detectable）计算，以减少）计算，以减少0 0值对值对AUCAUC计算的计算的影响。影响。（九）、作为外源性药物使用的内源性物质的测定（九）、作为外源性药物使用的内源性物质的测定 1 1、对生物介质进行处理：活性炭吸附或透析去除所含药
44、物、对生物介质进行处理：活性炭吸附或透析去除所含药物 2 2、使用不含内源性物质的生物介质、使用不含内源性物质的生物介质 3 3、使用替代介质、使用替代介质 4 4、采用标准加入法、采用标准加入法（十）、微生物学和免疫选方法的验证（十）、微生物学和免疫选方法的验证（十一）、名词解释（十一）、名词解释 标准物质、生物介质、介质效应、标准样品、质控样品、标准物质、生物介质、介质效应、标准样品、质控样品、质控样品池、未知样品、制备样品、分析批质控样品池、未知样品、制备样品、分析批残留残留应该在方法建立中考察残留并使之最小。通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白
45、样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。为确保残留不影响准确度和精密度。可以在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。基质效应当采用质谱方法时，应该考察基质效应。使用至少6 批来自不同供体的空白基质，不应使用合并的基质。对于每批基质，通过计算基质存在下的峰面积（空白基质提取后加入分析物和内标），与不含基质的相应峰面积（分析物和内标的纯溶液）比值，计算每一分析物和内标的基质因子。已测样品再分析当存在蛋白结合以及已知和未知代谢物的回复转化、样品均一性或同服药物引起的差异，可能影响样品在处理和储存过程中分析物的准确度和精密度时需要进行样品再分析。推荐通过在一定时间周期内重新分析试验样品，来评价实际样品测定的准确度。推荐从几名受试者处获得样品进行再分析，接近预期的最大浓度及消除相浓度。样品不应合并。