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1、第五章第五章 案例分析案例分析药物设计药物设计案例分析一：案例分析一：波西匹韦的发现波西匹韦的发现案例分析二：抗疟药物靶点案例分析二：抗疟药物靶点Plasmepsin Plasmepsin 抑制剂的筛选抑制剂的筛选案例分析三：基于靶点结构的药物设计在案例分析三：基于靶点结构的药物设计在 HIV HIV蛋白酶先导化合物发现的蛋白酶先导化合物发现的 应用应用案例分析案例分析一：一：波西匹韦的发现波西匹韦的发现一、研究背景一、研究背景丙型肝炎由丙型肝炎病毒丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要经感染所致，主要经血液血液/体液传播。据世界卫生组织统计，全球体液传播。据世界卫生组织统计，全球HC
2、V的感的感染率约为染率约为3%，约，约1.8亿人感染亿人感染HCV，60%70%的感染的感染人群发病，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分人群发病，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为患者可发展为肝硬化肝硬化甚至肝癌。甚至肝癌。HCV是一种高度易变异性病毒，根据其基因序列的差是一种高度易变异性病毒，根据其基因序列的差异，可以分为异，可以分为、等等6种种基因型基因型和和12种基因亚型种基因亚型，各基因型间没有免疫力，相互之间可以重复感染，这各基因型间没有免疫力，相互之间可以重复感染，这使得研制预防性和治疗性疫苗存在很大困难。近使得研制预防性和治疗性疫苗存在很大困难。近5年抗年抗丙型肝
3、炎药物取得重大突破，下面以丙型肝炎药物取得重大突破，下面以NS3/4A蛋白酶抑蛋白酶抑制剂制剂（NS3/4A protease inhibitor）波西匹韦波西匹韦（baceprevir）为例，说明基于酶蛋白结构的合理设计为例，说明基于酶蛋白结构的合理设计过程。过程。NS3/4A蛋白酶对蛋白酶对HCV的生长和增殖具有重要作用，的生长和增殖具有重要作用，是研究抗是研究抗HCV药物的理想靶标。药物的理想靶标。NS3/4A蛋白酶的单晶蛋白酶的单晶X射线分析提示，其活性中心是射线分析提示，其活性中心是处于酶的表面，呈平坦状展开，没有明显特征的疏水处于酶的表面，呈平坦状展开，没有明显特征的疏水性结构域，
4、而且被水分子覆盖。催化核心是由性结构域，而且被水分子覆盖。催化核心是由N端的端的His57和和Asp81、C端的端的Ser139三元体构成。底物三元体构成。底物P1位位置为置为Cys或或The，P1为疏水性、小体积氨基酸为疏水性、小体积氨基酸Ala或或Ser，P2、P3和和P4为疏水性氨基酸，为疏水性氨基酸，P5和和P6为为Asp或或Glu等酸性氨基酸残基。等酸性氨基酸残基。二、苗头化合物的发现二、苗头化合物的发现由于酶与底物的结合以在较大范围发生、多位点的弱由于酶与底物的结合以在较大范围发生、多位点的弱结合力为特征，研究筛选小分子化合物以其达到抑制结合力为特征，研究筛选小分子化合物以其达到抑
5、制NS3/4A蛋白酶的目的并不成功，而模拟天然底物的长蛋白酶的目的并不成功，而模拟天然底物的长链肽，进行设计与修饰成为有效途径。化合物（链肽，进行设计与修饰成为有效途径。化合物（4-50）与）与NS3/4A蛋白酶活性中心的结构相匹配，且酮基蛋白酶活性中心的结构相匹配，且酮基酰胺处于合适的位置，可与酰胺处于合适的位置，可与Ser139发生亲核性进攻，发生亲核性进攻，形成稳定的共价键，成为不可逆性抑制剂，如下图所形成稳定的共价键，成为不可逆性抑制剂，如下图所示。示。-酮基酰胺片段与丝氨酸的羟基发生亲酮基酰胺片段与丝氨酸的羟基发生亲核进攻形成共价结合的示意图核进攻形成共价结合的示意图三、先导化合物的
6、确定及优化三、先导化合物的确定及优化1.减少氨基酸残基，由十一肽减为五肽减少氨基酸残基，由十一肽减为五肽2.改变侧链基团，再减少氨基酸残基改变侧链基团，再减少氨基酸残基四、上市药物波西匹韦的确定四、上市药物波西匹韦的确定在临床前研究中，化合物（在临床前研究中，化合物（4-53）表现出良好的开发）表现出良好的开发价值，被命名为波西匹韦（价值，被命名为波西匹韦（baceprevir），最终在），最终在2011年年5月上市。月上市。波西匹韦与波西匹韦与NS3/4A复合物的单晶复合物的单晶X射线衍射图显示，两射线衍射图显示，两个叔丁基分别与个叔丁基分别与S4和和S3疏水腔发生疏水相互作用，疏水腔发生疏
7、水相互作用，P2的二甲基环丙并脯氨酸片段呈弯曲构象，与酶的的二甲基环丙并脯氨酸片段呈弯曲构象，与酶的Ala156、His57和和Arg155侧链发生最大限度的疏水性交盖，环丁侧链发生最大限度的疏水性交盖，环丁基占据了基占据了S1腔，腔，-酮基酰胺的羰基与酮基酰胺的羰基与Ser139形成可逆的形成可逆的共价结合，整个化合物骨架与酶发生多处的氢键结合。共价结合，整个化合物骨架与酶发生多处的氢键结合。波西匹韦与波西匹韦与NS3/4A复合物单晶复合物单晶X射线衍射图射线衍射图索非布韦片（Sovaldi）索非布韦片（Sovaldi，通用名：Sofosbuvir）是由Pharmasset公司研制后被吉利德
8、（Gilead）2011年以110亿美元收购的丙型肝炎药物，是一种NS5B聚合酶抑制剂。2013年12月6日获得FDA批准用于基因1型，2型，3型和4型慢性丙型肝炎（Hepatitis C）成人患者的治疗。2014年9月14日吉列德和印度7家仿制药厂达成的非排他自愿授权协议，后来又陆续有其他药厂加入该协议。索非布韦片（Sovaldi）2017.09.21，中国人终于迎来了吉利德第一代丙肝药即Sovaldi(sofosbuvir)的上市，11月27日吉利德公布丙肝药索非布韦在华售价，最终定价为19660元/瓶，销售规格为28片/瓶的索非布韦片。按照每三个月为一个疗程来计算，则一个疗程的价格为58
9、980元。案例分析二：案例分析二：抗疟药物靶点抗疟药物靶点P Plasmepsinlasmepsin 抑制剂的筛选抑制剂的筛选疟疾是一种由寄生虫引起的疾病，每年都有高达疟疾是一种由寄生虫引起的疾病，每年都有高达300百万百万500百百万的人饱受其折磨，而其中万的人饱受其折磨，而其中1百万百万2百万的患者会因无法治愈而百万的患者会因无法治愈而导致死亡。据导致死亡。据WHO统计，统计，2009年全球有年全球有2.25亿人感染疟疾，并亿人感染疟疾，并有有781 000人死于该疾病。人死于该疾病。据估算，将近据估算，将近40%的世界人口所居住的的世界人口所居住的地区，疟疾都是区域性疾病。地区，疟疾都是
10、区域性疾病。由于治疗条件及药物的滥用，一些传统的抗疟药物如氯喹和青蒿由于治疗条件及药物的滥用，一些传统的抗疟药物如氯喹和青蒿素也逐渐出现了使用耐药性，感染疟疾和死亡的人数又进一步增素也逐渐出现了使用耐药性，感染疟疾和死亡的人数又进一步增加。加。Plasmodium falciparum（恶性疟原虫）是四种疟原虫中最危险的（恶性疟原虫）是四种疟原虫中最危险的一种，也是感染人类以及引起死亡率达一种，也是感染人类以及引起死亡率达95%的主要原因。的主要原因。随着随着P.falciparum抗药性对现有医疗手段阻力的增加，疟疾逐抗药性对现有医疗手段阻力的增加，疟疾逐渐引起国际健康协会对其的高度重视。渐
11、引起国际健康协会对其的高度重视。疟原虫能够降解宿主红细胞内的大部分血红蛋白，并且利用疟原虫能够降解宿主红细胞内的大部分血红蛋白，并且利用这一机制得到的氨基酸合成自身的蛋白质。这一机制得到的氨基酸合成自身的蛋白质。几种不同类型的酶一次参与催化降解血红蛋白的过程，分别几种不同类型的酶一次参与催化降解血红蛋白的过程，分别是天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和胞质氨是天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和胞质氨肽酶。肽酶。Plasmepsins 属于天冬氨酸蛋白酶家族，恶性疟原虫编码属于天冬氨酸蛋白酶家族，恶性疟原虫编码10个个天冬氨酸蛋白酶，其中四个蛋白酶能降解血红蛋白，分别是天冬氨酸
12、蛋白酶，其中四个蛋白酶能降解血红蛋白，分别是Plm I、Plm II、HAP和和Plm IV。PM I和和PM II能够催化血红蛋白能够催化血红蛋白链链Phe33和和Leu34实现实现最初降解，随着对其功能研究的深入，最初降解，随着对其功能研究的深入，PM II现已成为现已成为一个抗疟药物研发最具吸引力的靶标之一。一个抗疟药物研发最具吸引力的靶标之一。Hague等报道了利用几个重复的数据库，采用组合化等报道了利用几个重复的数据库，采用组合化学和基于结构设计的方法相结合的方式，来辨别几个学和基于结构设计的方法相结合的方式，来辨别几个具有潜在活性（具有潜在活性（Ki210nmol/L）和具有选择性
13、（相）和具有选择性（相对于组织蛋白酶高达对于组织蛋白酶高达15倍）、低分子量的抑制剂。倍）、低分子量的抑制剂。羟基乙胺核心结构羟基乙胺核心结构Haque等对等对Plm 的潜在抑制剂的潜在抑制剂研究，研究，从对比从对比Plm 和组织蛋白酶和组织蛋白酶D（Cathepsin D,Cat D）与基于肽的天）与基于肽的天然产物抑肽素然产物抑肽素(pepstatin)共聚晶体结构出发。共聚晶体结构出发。Plm 和和Cat D具有明显的序列同源性（具有明显的序列同源性（35%），而在活性位），而在活性位点区域，其序列同源性更高。之前，他们采用设计、点区域，其序列同源性更高。之前，他们采用设计、合成和虚筛一
14、个含有合成和虚筛一个含有1039个化合物的抑制剂数据库，个化合物的抑制剂数据库，已成功验证了潜在已成功验证了潜在Cat D抑制剂，研究发现具有羟基乙抑制剂，研究发现具有羟基乙胺核心结构的化合物对胺核心结构的化合物对Plm 和和 Cat D均有很好的抑均有很好的抑制活性。由于制活性。由于Plm 和和Cat D的相似性，他们通过虚筛的相似性，他们通过虚筛该数据库为得到先导化合物。该数据库为得到先导化合物。基于结构设基于结构设计的策略计的策略案例分析案例分析三三：基于靶点结构的药物设计在基于靶点结构的药物设计在HIVHIV蛋白蛋白酶先导化合物发现的应用酶先导化合物发现的应用美国美国1981年报告首例
15、年报告首例AIDS病例。病例。AZT是首次经是首次经FDA批准用于临床的抗批准用于临床的抗AIDS药物，它药物，它与随后批准的与随后批准的DDI、DDC、D4T和和3TC同属核苷类同属核苷类HIV逆转录酶抑制剂。逆转录酶抑制剂。AIDS主要由主要由HIV-1引起，有多种酶发挥作用，其中引起，有多种酶发挥作用，其中逆转录酶逆转录酶(RT)、蛋白酶、蛋白酶(PR)和整合酶和整合酶(IN)受到现代受到现代药物开发关注。药物开发关注。HIV-1蛋白酶是天门冬氨酸属蛋白水解酶，是由两蛋白酶是天门冬氨酸属蛋白水解酶，是由两条肽链组成的同质二聚体条肽链组成的同质二聚体(homodimer)，每一条肽，每一条
16、肽链由链由99个氨基酸组成。个氨基酸组成。Peal等测定了等测定了HIV-1蛋白酶晶蛋白酶晶体的三维结构，发现有体的三维结构，发现有C2对称轴，其活性中心由两对称轴，其活性中心由两部分组成。部分组成。一、研发背景一、研发背景一、研发背景一、研发背景当前以当前以HIV-1蛋白酶为靶点寻找蛋白酶抑制剂可归蛋白酶为靶点寻找蛋白酶抑制剂可归纳为纳为3个研究方向：个研究方向：（1）根据根据HIV-1蛋白酶具有蛋白酶具有C2对称轴，设计能对称轴，设计能够阻止两个单体聚合或将已聚合的二聚体解聚够阻止两个单体聚合或将已聚合的二聚体解聚的化合物。的化合物。（2）大部分抑制剂是根据大部分抑制剂是根据HIV的的ga
17、g和和gag-pol基因产物中至少存在基因产物中至少存在7个裂解键而设计的，用个裂解键而设计的，用不易裂解的化学键替代肽底物中的酰胺键，以不易裂解的化学键替代肽底物中的酰胺键，以合成肽底物的类似物。合成肽底物的类似物。（3）通过大规模普筛及借助于晶体结构数据通过大规模普筛及借助于晶体结构数据和计算机分子图形学的计算机辅助药物设计和计算机分子图形学的计算机辅助药物设计（CADD）寻找生物活性较强的小分子非肽寻找生物活性较强的小分子非肽类抑制剂，再进一步结构优化。这个研究方类抑制剂，再进一步结构优化。这个研究方向已成为研制新型的抗艾滋病药物的一个新向已成为研制新型的抗艾滋病药物的一个新热点。热点。
18、二、先导化合物的发现二、先导化合物的发现研究表明，每个研究表明，每个HIV-1蛋白酶亚基由蛋白酶亚基由99个氨基酸个氨基酸残基组成，该酶抑制剂必须具有渗透细胞膜的残基组成，该酶抑制剂必须具有渗透细胞膜的能力。通过对能力。通过对HIV-1蛋白酶与天门冬氨酸蛋白酶蛋白酶与天门冬氨酸蛋白酶的结构进行比较，并借助的结构进行比较，并借助X-衍射波谱的结果，衍射波谱的结果，人们获得了高精确度人们获得了高精确度（1.8nm）的的HIV-1蛋白酶蛋白酶的三维结构，并建立起该酶的结构模型。的三维结构，并建立起该酶的结构模型。随后，随后，Kuntz等人于等人于1990年根据其晶体结构中的酶活性年根据其晶体结构中的
19、酶活性部位，利用部位，利用DOCK程序将剑桥晶体数据库中的程序将剑桥晶体数据库中的10 000个个分子与之进行分子对接虚拟筛选，并按照打分数值的分子与之进行分子对接虚拟筛选，并按照打分数值的高低排列。然后对打分值最高的高低排列。然后对打分值最高的200个化合物进行严格个化合物进行严格筛选，选择筛选，选择那些那些带有羟基或氨基且易于合成的化合物，带有羟基或氨基且易于合成的化合物，并评价这些分子能否与酶的并评价这些分子能否与酶的Asp25发生相互作用。最后发生相互作用。最后发现其中一个化合物发现其中一个化合物bromoperidol（11-60）具有较好具有较好的结合作用。的结合作用。通过肽底物的
20、酶活性检定法进行药理筛选，结果表明通过肽底物的酶活性检定法进行药理筛选，结果表明haloperidol（11-61）有抑制有抑制HIV-1蛋白酶的活性蛋白酶的活性（Ki100mol/L，IC500.25mmol/L，IC902.0mmol/L）。另外，此化合物对另外，此化合物对HIV-1蛋白酶同属天冬氨酸蛋白酶的人蛋白酶同属天冬氨酸蛋白酶的人血管紧张肽原酶血管紧张肽原酶（human renin）无抑制作用，对胃蛋白无抑制作用，对胃蛋白酶酶（pepsin）的抑制作用较弱，其选择性较高。的抑制作用较弱，其选择性较高。随后他们对此化合物进行结构修饰与改造，得到硫缩随后他们对此化合物进行结构修饰与改造
21、，得到硫缩酮衍生物酮衍生物thioketal（11-62），此化合物对，此化合物对HIV-1蛋白酶蛋白酶的抑制活性为的抑制活性为15mol/L，其活性得到进一步的提高。，其活性得到进一步的提高。随后他们对化合物随后他们对化合物thioketal（11-62）与与HIV-l蛋白酶复蛋白酶复合物的晶体结构进行分析，发现其结合模式与分子对合物的晶体结构进行分析，发现其结合模式与分子对接得到的结果略有不同。接得到的结果略有不同。进一步阅读进一步阅读Brik Ashraf,Wong Chi-Huey.HIV-1 protease:mechanism and drug discovery.Organic&
22、Biomolecular Chemistry.2003,(1):514.Erik De Clercq.The design of drugs for HIV and HCV.Nature Reviews Drug Discovery.2007,6(12):1001-1018.Peng Zhan,Christophe Pannecouque,Erik De Clercq,Xinyong Liu.Anti-HIV Drug Discovery and Development:Current Innovations and Future Trends.Journal of Medicinal Chemistry.2016,59(7):2849-2878.