分子生物学实验指导手册.docx

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1、分子生物学试验指导手册目录试验一培育基的配制及试验用品的灭菌1试验二质粒DNA 的分别提取2试验三质粒DNA 浓度和纯度的测定4试验四DNA 的琼脂糖电泳鉴定4试验五大肠杆菌感受态细胞的制备5试验六重组子的转化及阳性克隆的初步筛选6试验七PCR7试验八DNA 的酶切及电泳鉴定8试验一培育基的配制及试验用品的灭菌一、目的1.1 了解并把握培育基的配制、分装方法1.2 把握各种试验室灭菌方法及技术。二、原理培育基是供微生物生长、生殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的养分类型，对养分物质的要求也各不一样，加之试验和争论的目的不同，所以培育基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从养分 角度分析，培

2、育基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培育基还 应具有适宜的pH 值、确定的缓冲力气、确定的氧化复原电位及适宜的渗透压。琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培育基在 98100 下溶化，于 45以下凝固。但屡次反复溶化，其凝固性降低。任何一种培育基一经制成就应准时彻底灭菌，以备纯培育用。一般培育基的灭菌承受高压蒸汽灭菌。三、材料1、器皿及材料天平、称量纸、药品匙、量筒、试管、三角瓶、培育皿、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、灭菌锅、枯燥箱、1.5ml EP 管、PCR 管、枪头、枪头盒2、药品试剂

3、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂粉四、步骤1、LB 液体培育基的配置及分装配置：称取胰蛋白胨 2.5g，酵母提取物 1.25 g，NaCl 2.5 g，溶于 200ml 蒸馏水中，彻底溶解后，加蒸馏水定容至总体积 250ml。分装：量取 100ml LB 液体培育基分装到 250ml 锥形瓶中，量取 5ml LB 液体培育基分装到玻璃试管中，共分装 2 个锥形瓶、5 支试管。2、LB 固体培育基的配置称取 1.5g 琼脂粉，参与至 100ml LB 液体培育基中。13、包扎标记培育基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸或报纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培育基名称，制备组别和姓名、日期等

4、。4、其他试验用品的包装标记在铝饭盒中放入 1.5ml EP 管、PCR 管及 2 个 50ml 离心管旋松管盖，用棉绳系好，标记组别、姓名等；用防潮纸或报纸包好 5 个玻璃培育皿，标记组别和姓名等。5、灭菌把上述配好的各种培育基、试验用品放入高压蒸汽灭菌锅中，121灭菌 20-30min，灭菌完毕后放入枯燥箱烘干备用。6、含氨苄青霉素的LB 固体平板制备待 LB 固体培育基冷却到 60时，在超净工作台中参与氨苄青霉素，使其终浓度为 100ug/ml，混匀后倒入灭菌的玻璃培育皿中，待培育基凝固后4保存备用。倒平板的方法：右手持盛培育基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试

5、 管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手 边缘或小指与无名指之间夹住。假设试管内或三角瓶内的培育基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。 左手拿培育皿并将皿盖在火焰四周翻开一缝，快速例入培育基约 15m1，加盖后轻轻摇动培育皿，使培育基均匀分布在培育皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。7、液体接菌培育用微量移液枪吸取 10ul 菌液接种至灭菌的 5ml LB 液体培育基中，37振荡培育过夜，用于制备感受态试验。在灭菌的 5ml LB 液体培育基中参与 5ul 氨苄青霉素100mg/ml，混匀后接入 10ul TOP10 大肠杆菌含

6、 pLenti6-GFP 质粒，37振荡培育过夜，用于质粒提取试验。接菌的方法：按无菌操作法挑取少量菌种，先用微量移液枪吸取 10ul 菌液，左手持盛培育基的试管或三角瓶置火焰旁边，用右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘 或小指与无名指夹住管(瓶)塞，将枪头中的细菌接种到试管或三角瓶中，将试管塞或瓶塞盖好。五、结果预备好各种灭菌的培育基及试验用品用于后续试验六、思考1、制备培育基的一般程序是什么？2、做过本次试验后，你认为在制备培育基时要留意些什么问题？3、灭菌在微生物学试验操作中有何重要意义？4、试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。5、高压蒸汽灭菌时应留意哪

7、些事项？试验二质粒 DNA 的分别提取一、目的把握质粒DNA 分别纯化的原理与操作步骤； 二、原理从大肠杆菌中提取质粒DNA 常用碱性SDS 法，该法提取质粒是基于质粒与染色体DNA 的变性存在差异而予以分别的。在强碱性条件下，染色体DNA 和质粒DNA 均变性双链解开。由于质粒 DNA 分子小，而且是共价闭合环状超螺旋构造，变性后两条互补链不会完全分开。当溶液PH 调整到中性时，质粒 DNA 简洁复性并溶解在溶液中，而染色体DNA 不简洁复性，相互缠绕，在离心时极易和蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来。转移出上清液，再用乙醇沉淀出其中的质粒DNA。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在

8、。在提取质粒过程中，除了超螺旋 DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。假设质粒 DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消退链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA) ；假设质粒 DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA) 。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。三、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、小型高速离心机2、试剂：快速质粒小提试剂盒世纪康为 CW0511，组分包括Buffer P1：50mmol/L 葡萄糖 5mmol/L

9、 Tris.ClpH8.0 10mmol/L EDTApH8.0 Buffer P2：0.2mol/L NaOH，1%W/VSDS颖配置。Buffer N3：5mol/L 乙酸钾 60mL，冰乙酸 11.5mL，双蒸水 28.5mL。Buffer PW：含有 75%乙醇的缓冲液SpinColumnCM吸附柱 四、操作步骤1、用微量移液器吸取10ul 菌液，接种至 5mL 含 100ug/ml 氨苄青霉素的LB 液体培育基中，37 220rpm摇床培育过夜试验一中已完成。2、将 1.5mL 过夜培育的菌液转移至 1.5ml EP 管Eppendorf 离心管内，10000rpm 离心 30 秒，

10、弃上清。3、向留有菌体沉淀的离心管中参与250ul 预冷的Buffer P1，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀。4、向离心管中参与 250ul Buffer P2，温存地上下颠倒混匀4-6 次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液应变得清亮粘稠。留意：温存混匀，不要猛烈震荡，以免造成基因组DAN 污染，此步骤所用时间应不超过5 分钟，避开质粒受到破坏。5、向离心管中参与350ul Buffer N3，马上温存地上下颠倒混匀4-6 次，充分混匀，此时应消灭白色絮状沉淀，13000rpm 离心 10 分钟。留意：Buffer N3 参与后应马上混匀，避开产生局部沉淀。6、将步骤 5 中所得的上

11、清液转移到已装入收集管的吸附柱中，13000rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重放回收集管中。7、向吸附柱中参与 750ul Buffer PW，13000rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液。8、将吸附柱重放回收集管中，13000rpm 离心 2 分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。留意：这一步的目的是将吸附柱中剩余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反响酶切、PCR 等。9、将吸附柱置于一个的EP 管中，向吸附膜的中间部位参与30ul 灭菌蒸馏水，室温放置 5 分钟，13000rpm 离心 2 分钟，将质粒溶液收集到离心管中，-20保存备用。试验三

12、 质粒 DNA 浓度和纯度的测定一、目的1、了解分光光度法测定DNA 浓度和纯度的原理2、把握分光光度法测定DNA 浓度和纯度的方法二、原理质粒DNA 样品的浓度和纯度是后续试验的关键，因此要对分别纯化的质粒进展浓度、纯度的测定。核酸含量测定方法包括定磷法、紫外吸取法、地衣酚法和二苯胺法等，还可利用琼脂糖凝胶电泳推断核酸的浓度和纯度。其中紫外吸取法简洁快捷、灵敏度高，是试验室中最常用的方法。核酸分子构造中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在250-280nm 紫外光区具有猛烈的光吸取作用， 最大吸取值在 260nm 左右，因此可利用核酸的紫外吸取兴致进展定量测定。目前常利用分光光度计测定核酸溶液在

13、 260nm 处的吸光值，通常 1OD 值的光密度相当于双链DNA 浓度为 50ug/ml；单链DNA 或RNA 为 40ug/ml；可以此来计算核酸样品的浓度通常1ug/ml 的DNA 标准品溶液在 260nm 光吸取值为0.020；1ug/ml 的 RNA 溶液为 0.022，以此为标准，可测得溶液中的核酸含量。利用分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 的紫外线吸取值的比值A260/A280可以推断核酸样品的纯度。纯DNA 的 A260/A280 约为 1.8；RNA 的A260/A280 约为 2.0。DNA 和RNA 的比值分别低于 1.8 和 2.0 时，则表示此样品

14、不纯，可能含有蛋白质等杂质。假设DNA 比值高于 1.8，说明样品中有RNA 污染。固然也会消灭既含有RNA 的 DNA 溶液比值为 1.8 的状况，所以需要结合琼脂糖凝胶电泳等方法进一步进展测定。【计算】DNA 浓度ug/ml=A2601ug/ml稀释倍数/0.020 DNA 纯度=A260/A280要求比值在 1.8-2.0 范围内三、仪器与试剂紫外分光光度计、微量移液器、石英比色皿、质粒溶液、蒸馏水四、步骤1、样品预备：取试验二中提取得到的质粒溶液200ul，参与蒸馏水 1800ul，混匀后待用。2、以蒸馏水调零，用紫外分光光度计测定质粒溶液在260nm、280nm 的吸光度值。3、计算

15、出DNA 的浓度及纯度，分析是否有RNA 或蛋白质污染。试验四DNA 的琼脂糖电泳鉴定一、目的把握琼脂糖凝胶制备与电泳的原理与方法。二、原理核酸带负电荷，在电场中向正极移动，移动快慢与分子大小成反比。电泳后，核酸在凝胶中的位置通过“染色”来显现。染色剂溴化乙锭EB，它能插入DNA 积叠的碱基之间，导致和DNA 结合。在紫外光照耀下，溴化乙锭-DNA 复合物放射出橘红色荧光。三、仪器与试剂1、仪器电泳仪；电泳槽；紫外核酸检测仪2、试剂TAE 电泳缓冲液50：每升含 Tris 242g，冰乙酸 57.1mL，0.5mol/L EDTApH8.0100mL DNA Marker：1kb ladder

16、、DM2023 plus6DNA loading buffer 上样缓冲液 四、操作步骤1、将制胶板水平放置于模具内，插入适宜的梳子；2、称取 1g 琼脂糖于 100 ml 1 TAE 中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50C 时倒入制胶板中；3、凝胶凝固后，留神拔去梳子，将制胶板放入电泳槽中，参与1TAE 电泳缓冲液；4、吸取提取的质粒DNA 5ul，6上样缓冲液 1ul，混匀后点入加样孔中，另外吸取5ul DNA Marker依次点入加样孔中；5、盖好盖子，翻开电泳仪，使核酸样品向正极泳动，100V 约 30 分钟；6、电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入1ug/ml EB 溶

17、液中避光染色 5 分钟，染色完毕后把凝胶置于紫外透射仪上观看电泳结果，并照相记录。试验五大肠杆菌感受态细胞的制备一、目的把握感受态细胞的制备原理与操作步骤； 二、原理在自然条件下, 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到的宿主内, 但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M), 它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些

18、特别方法( 如电击法，CaCl2 等化学试剂法) 的处理后, 细胞膜的通透性发生了临时性的转变, 成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移, 使受体细胞消灭的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培育基中培育，即可筛选出转化子( 即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 法，CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般试验的要求, 制备出的感受态细胞临时不用时, 可参与占总体积15的无菌甘油于-70 保存(半年), 因此CaCl2 法使用更广泛。三、仪器与试剂 1、仪器恒温摇床；冷冻离心机；

19、制冰机；分光光度计；超净工作台；灭菌的离心管50ml 和 1.5ml； 2、试剂10.1mol/L CaCl2 溶液:称取1.11g CaCl2( 无水,分析纯), 溶于50ml 重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。2含 15%甘油的 0.1mol/L CaCl2: 称取 1.11g CaCl2( 无水,分析纯), 溶于 50ml 重蒸水中,参与 15ml甘油,定容至 100ml,高压灭菌。四、操作步骤一细菌的培育吸取 10ul TOP10 大肠杆菌菌液，接种于5ml LB 液体培育基中,37 下过夜振荡培育试验一中已完成。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 100ml LB

20、液体培育基中,37振荡培育 2-3 小时至OD600 0.4-0.6 左右。二感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培育液转入 50ml 离心管中,冰上放置 10 分钟,然后于 4下 4000rpm 离心 10 分钟。2、弃去上清，用预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置 15-30 分钟后,4下4000rpm 离心 10 分钟。3、弃去上清,参与 2ml 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成 200l 的小份，可直接用于转化试验，也可贮存于4可保存一周。五、留意事

21、项1、试验中所用的器皿均需要高压灭菌，以防止杂菌和外源DNA 的污染。2、试验过程中要留意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进展。3、应收获对数生长期的细胞用于制备感受态，OD600 不应高于 0.64、制备感受态细胞需要高纯度的CaCl2，并用超纯水配制。5、整个试验确定要在冰浴条件下操作，温度时高时低会影响转化效率。试验六重组子的转化及阳性克隆的初步筛选一、目的学习将DNA 分子转化进入受体菌的方法。二、原理转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，体外连接的重组 DNA 分子必需经转化导入适宜的宿主细胞中才能大量的进展复制、增殖和表达。常用的转化方法有热激

22、法、电穿孔法，进入 受体细胞的 DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移, 使受体细胞消灭的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培育基中培育，即可筛选出转化子(Transformant, 即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。本试验用外源质粒pLenti6-GFP 转化大肠杆菌TOO10 感受态细胞进展复制扩增。用含氨苄青霉素的琼脂平板进展转化子的初步筛选，转化成功的受体菌具有氨苄的抗性，能够在含有抗生素的培育基上存活， 而未受转化的受体细胞则因缺乏抵抗抗生素的力气而死亡。三、步骤1、制备或 4保存的感受态细胞悬液, 参与质粒 DNA 溶液 2-3ul(含量不超过 50ng,体积不超过 10

23、l), 轻轻摇匀,冰上放置 30 分钟。2、42水浴中热击 90 秒，热击后快速置于冰上冷却 3-5 分钟。3、 向管中参与 1ml LB 液体培育基(不含 Amp), 混匀后 37振荡培育 1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ) 。4、将上述菌液摇匀后取 100 l涂布于含 Amp 的筛选平板上,正面对上放置半小时,待菌液完全被培育基吸取后倒置培育皿,37培育 16-24 小时。5、结果：培育皿中可见一个个菌落即为转化成功的阳性克隆。四、留意事项1、转化效率与外源DNA 的浓度成正比，假设参与外源DNA 的量过多或体积过大，转化效率也都会下降，所以一般

24、状况下DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10%。2、42热处理很关键，温度要准确，转移速度要快。试验七PCR一、目的把握PCR 原理与操作步骤； 二、原理PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反响)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 的方法.它包括三个根本步骤:1、变性(Denature):目的双链DNA 片段在 94下解链;2、退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50 左右) 下与模板上的目的序列通过氢键配对;3、延长(Extension): 在Taq DNA 聚合酶合成 DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进展合成.由这三个根本

25、步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经 25-35 轮循环就可使DNA 扩增达 106 倍。本试验是从pLenti6-GFP 质粒上扩增GFP绿色荧光蛋白基因。三、仪器与试剂1、仪器：PCR 仪2、试剂2Taq DNA 聚合酶预混液含PCR buffer Mg2+、Taq 酶、dNTP、染料；模板DNAplenti6-GFP 质粒引物各 10uM：GFP-F:GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG GFP-R:CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG四、操作步骤1、PCR 反响体系20u

26、l2PCR buffer含Taq 酶及染料10l模板1lGFP-F10M1lGFP-R10M1l灭菌水7l2、PCR 反响程序预变性945min变性9430s退火5530s30 个循环延长721min终延长7210min3、产物分析取 10l PCR 产物参与琼脂糖凝胶孔中，100V 电泳，至指示带电泳至 2/3 凝胶处时停顿电泳，取出凝胶，凝胶成像仪中观看并拍照。五、思考题1、降低退火温度对反响有何影响？2、延长变性时间对反响有何影响？3、循环次数是否越多越好？为何？4、假设消灭非特异性带,可能有哪些缘由？试验八DNA 的酶切及电泳鉴定一、目的把握DNA 酶切的原理与操作步骤； 二、原理限制

27、性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其四周的特异位点上, 并切割双链DNA 。它可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依靠于 ATP 的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA ，而类酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得 到了广泛应用，它们是重组 DNA 的根底。绝大多数类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识

28、别六个核苷酸序列:5”- G AATTC-3”), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma :5”-CCCGGG-3”); 有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端,如 EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。限制性内切酶的酶解反响最适条件各不一样, 各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反响温度( 大多数为 37)。对质粒 DNA 酶切反响而言, 限制性内切酶用量可按标准体系 1 g DNA 加 1 单位酶,消化1-2 小时。但要完全酶解则必需增加酶的用量,一般增加 2-3 倍,甚至更多,反响时间也要适当延长。三、仪器与试剂1、仪器：水浴锅、电泳仪2、试剂：限制性内切酶及其缓冲液四、操作步骤1、酶切反响体系反响体系质粒DNA 10酶反响缓冲液BamH IEcoR IddH2O20ul 10ul 2 ul1 ul1ul 6ul混匀后瞬时离心，置于 37 度反响 1 小时。2、电泳按前面所述,取 10l 扩增产物用 1琼脂糖凝胶进展电泳分析,检查反响产物及长度。