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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流分子生物学实验指导.精品文档.分子生物学实验指导实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。实验目的学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。实验原理植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如
2、CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下， 结合 65 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂
3、将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/2801.8，纯的RNA样品A260/2802.0，并且1g/ml DNA溶液A260=0.020。实验器材1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料实验试剂1、3CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris 25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% -巯基乙醇2、TE
4、缓冲液（pH8.0）10mmol/L TrisHCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95乙醇5、液氮 实验步骤1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4下8000rpm离心10min。6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净
5、的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。8、小心取下这些纤维状沉淀，加12 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。9、将粗制品溶于TE缓冲液。10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。实验结果第一组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶液A260=0.022，A280=0.012，A260/2
6、801.83第二组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶液A260=0.020，A280=0.011，A260/2801.81第三组：得到纯化的DNA，经紫外分光光度计检测，样品DNA溶液A260=0.024，A280=0.013，A260/2801.84 注意事项1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。思考题CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？液氮研磨的原理是什么？实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是 D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼
7、脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0-9.0 的缓冲液中稳定。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。实验目的学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上
8、的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open
9、circular DNA ,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA, 简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。溴化乙锭可以嵌入核酸分子，并且在紫外灯下产生荧光，可用于检测核酸物质。实验器材1、琼脂糖凝胶电泳系统2、凝胶成像系统3、DNA marker4、检测样品5、琼脂糖实验试剂1、5TBE（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml 5TBE：Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.
10、0）2、凝胶加样缓冲液（6）溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%3、溴化乙锭溶液（EB） 0.5g/ml实验步骤（一）制备琼脂糖凝胶1、按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-42.0 0.1-32、称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。（二）胶板的制备1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不
11、能留缝隙）。2、有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3、将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。4、待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。5、加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。（三）加样用移液枪将将上样缓冲液与DNA样品按1:5比例混合，加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。（四）电泳1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。3、将凝胶小心放入溴化乙锭溶液中，
12、染色30min。4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。实验结果观察到较为明显的条带，分子量大的条带落后。注意事项因为EB是强致癌物质，因此染色操作中应注意安全不要接触，并且保持环境的洁净。参考文献精编分子生物学实验指南（第四版） 美 F M奥斯伯，R E 金斯顿等主编 科学出版社2005实验三 PCR基因扩增PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明的聚合酶链反应。这一技术具有划时代意义的。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及
13、延伸的温度与时间。实验目的学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1、变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、退火：使溶液温度降至5060，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3、延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（d
14、NTP），按53方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。实验器材1、PCR热循环仪2、tip头、冰盒3、PCR管4、超纯水5、DNA相对分子质量标准物6、移液枪实验试剂1、10缓冲液 500mmol/l KCl 100mmol/l TrisHCl(pH8.3 ,室温) 15m
15、mol/l MgCl2 0.1% 明胶2、4dNTP 1mmol/l dATP 1mmol/l dCTP 1mmol/l dGTP 1mmol/l dTTP3、Taq酶 5U/L4、DNA模板 1ng/L5、引物1 、引物2 引物溶液浓度 10pmol/l实验步骤1、在PCR管内配制20L反应体系：反应物 体积/L10buffer 2.0dNTP 1.0引物1 1.0 引物2 1.0 Taq酶 0.5Template 1ddH2O 13.5总体积 202、按下列程序进行扩增：、95预变性 5min、95变性 1min、55退火 1min、72延伸 1min、重复步骤30次；、72延伸 10mi
16、n3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制0.7%琼脂糖凝胶，取10L扩增产物电泳。保持电流40mA。电泳结束后，紫外灯下观察结果。实验结果紫外灯下能明显看到条带。注意事项1、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。2、取样时注意不要污染药品。思考题1、什么是引物二聚体？出现引物二聚体的原因是什么？2、PCR仪的热盖设置有什么优点？参考文献1、PCR技术操作和应用指南 主编 林万明 人民军医出版社 1995年2、PCR技术实验指南美C.W.迪芬巴赫 G.S.德维克斯勒 科学出版社 2003年实验四 目的基因片段与克隆载体质粒的连接仪器设备：低温水浴锅、冰箱、T4连接酶、外源DN
17、A与酶切的载体等。实验目的：重组DNA连接及鉴定重组子的方法。基本要求：学会按一定比例用T4噬菌体DNA连接酶进行连接反应。实验原理及步骤：外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做 重组子。重新组合的DNA分子是在连接酶的作用下进行连接的。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。连接反应总体积为10L，体系组成如下：回收纯化的PCR扩增目的基因片段 7.0L10Ligation buffer1.0LT载体（10ng/L）1.0LT4 DNA ligase1.0L共10.0ul混均后，4连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-S
18、TI。转化操作方法1）取一管-80保存的感受态细胞，置冰上融化；一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例：2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；3）将离心管置于42热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管；4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。5）将离心管内容物混匀，吸取100ul已转
19、化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50 ug/ml氨苄青霉素），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）实验结果培养板上有已转化的菌斑生成。注意事
20、项：1、感受态细胞应保存在-70，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。3、为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。4、氨苄青霉素(Amp)：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为50mg/mL。实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化过程
21、所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R，M)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。实验目的学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的实验技术及热激转化的实验技术。实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr
22、等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。实验器材1、超净工作台2、低温离心机3、恒温摇床4、恒温箱5、恒温水浴器6、ppendorf管、Tip头7、转化的目的质粒8、大肠杆菌菌株DH59、试管、培养皿、锥形瓶实验试剂1、1mol/l CaCl2溶液（高压灭菌）2、LB液体培养基 配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入： 胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g 酵母提取液（bacto-yeast extract） 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积1L，121湿热灭菌20 min。3、LB固
23、体培养基1000ml加15g琼脂。4、氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20冰箱保存。实验步骤1、从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的试管中，37振荡培养过夜。2、取0.5ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中，37振荡培养23 h。（此时，OD6000.40.5，细胞数务必108/ml，此为实验成功的关键）。3、吸菌液1ml加入Eppendorf 管，10,000rpm离心15sec回收细胞。4、用冰预冷的0.1mol/l CaCl2500L悬浮沉淀。5、再离心15 sec（10000rpm），回收细胞。6、再用冰预冷的
24、0.1mol/l CaCl260L重悬沉淀。7、在-4下可保存2周（24 d时，转化效率最高）。此细胞为感受态细胞。8、同时做两个对照管：受体菌对照：60L 感受态细胞 + 2L 无菌水质粒对照：60L 0.1mol/L CaCl2溶液 + 2L 质粒DNA溶液9、将管放到42循环水浴12min。10、冰浴2min。11、每管加800L LB液体培养基，37培养1 h（慢摇）。12、将适当体积（200L）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。13、倒置平皿37培养1216 h，观察细菌生长情况。实验结果在含有氨苄青霉素的培养皿中有菌斑生成注意事项1、超净上无菌操作注意安全。2、实验
25、过程中尽量避免杂菌污染。思考题1、CaCl2制备感受态的可能原因是什么？2、如果平板培养后出现卫星斑的可能原因是什么？3、如何提高转化的效率？参考文献精编分子生物学实验指南（第四版） 美 F M奥斯伯，R E 金斯顿等主编 科学出版社2005部分试剂配法：配制1MTris-HCl（中文名：三羟甲基氨基甲烷，氨基丁三醇，缓血酸铵）, pH8.5， 500ml ，配法是：60.55g Tris + 400ml H2O + 约20 ml 浓HCl，pH调至8.5，定容至500ml.EDTA标准溶液的配制与标定 1.EDTA标准溶液的配制（约0.02molL-1） 称取2.0g乙二胺四乙酸二钠（Na2
26、H2Y2H2O）溶于250mL蒸馏水中，转入聚乙烯塑料瓶中保存。 2.EDTA标准溶液浓度的标定 用20mL移液管移取Mg2+标准溶液于250mL锥形瓶中，加入10mL氨性缓冲溶液和34滴EBT指示剂，用0.02molL-1EDTA标准溶液滴定，至溶液由紫红色变为蓝色即为终点。平行标定3次。1）2CTAB 提取液（PH 8.0）：2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl，0.2%巯基乙醇。即称取CTAB 2 g加蒸馏水40ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml和5M NaCl 28ml,待CTAB溶解后用
27、蒸馏水定容到100ml（提取前加入2%的巯基乙醇，100ml加0.2ml巯基乙醇） 2）1M Tris-cl（PH 8.0）100 ml:12.11g Tris碱；ddH2O ，80ml；HCl，4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100ml 3）0.5M EDTA（PH 8.0） 100ml：在80ml水中加入18.01g EDTANa2.2H2O搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0（约2gNaOH颗粒），定容至100ml 4）5M NaCl 100ml：称取29.22g NaCl，用ddH2O定容到100ml 5）3M NaAc10ml：称取2.46g NaAc，
28、用ddH2O定容到10ml 操作步骤： 1、 称取1.0g幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入1.5ml离心管中，加入600 ul 65预热的CTAB溶液（用前加入2%的巯基乙醇） 2、 将装有CTAB和样品的EP管放入65水浴，约1h 3、 冷却后，加入600ul 的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，12000rpm，离心15min 4、 吸上清，装入一新的EP管 5、 加入600ul 氯仿：异戊醇（24:1=576:24），12000rpm。离心15min 6、 吸上清，转入一新的离心管中，加入1/3体积的NaAc（3mol/l） 7、 加入1ml-20预冷的无水乙醇，混匀后置于-20（-80，30min）3-4h 8、 12000rpm，10min弃上清 9、向离心管中加入75%的乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干 10、加入ddH2O（10-20ul）溶解 药品：Tirs碱、浓盐酸、EDTANa2.2H2O、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaAc、液氮、巯基乙醇 研钵、恒温水浴、离心机、离心管