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1、实验一蛋白质变性凝固及沉淀实验一蛋白质变性凝固及沉淀WT实验目的实验目的能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法能够运用盐析法及重金属沉淀法能够运用盐析法及重金属沉淀法第1页/共20页主要实验内容蛋白质的加热变性凝固蛋白质沉淀反应l l蛋白质盐析蛋白质盐析l l重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质l l生物碱试剂沉淀蛋白质生物碱试剂沉淀蛋白质第2页/共20页蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些理化因素的作用下，蛋白质严格的空间结构在某些理化因素的作用
2、下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质和生物学性质改变的现象。和生物学性质改变的现象。第3页/共20页 变性后的蛋白质称变性后的蛋白质称变性蛋白变性蛋白,能使蛋白质变性能使蛋白质变性的物质叫的物质叫蛋白质变性剂蛋白质变性剂。变性因素变性因素物理因素物理因素高温高温、高压、高压紫外线、紫外线、X射线、射线、电离辐射和超声波等电离辐射和超声波等化学因素化学因素强酸、强碱强酸、强碱有机溶剂、有机溶剂、重金属盐重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等高浓度尿素、盐酸胍等变性实质：变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、
3、破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、分子量不变）。分子量不变）。第4页/共20页变性的可逆性可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。利用利用消灭病原微生消灭病原微生物物蛋白质制剂的保存蛋白质制剂的保存保护体内蛋白质保护体内蛋白质避免避免第5页/共20页 蛋白质分子颗粒大小蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间之间,属胶体属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。原因原因蛋白质的胶体性质及沉淀蛋白质的胶体性质及沉淀:表面形成水化层表面形成水化层表面同种电荷的斥力表面同种电荷的斥力 除去这两
4、个因素，就会发生沉淀。蛋白质分除去这两个因素，就会发生沉淀。蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀沉淀。+第6页/共20页+-蛋白质胶体颗粒的沉淀 带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸酸酸碱碱碱碱脱水脱水脱水脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）带正电荷的蛋白质 （疏水胶体）带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）碱碱酸酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）-第7页/共20页可逆沉淀可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀结构和性质都不变结构和性质都不变适当条件下可重新溶解适当条件下可重新溶解是分离和纯化的基本方法是分离和纯化的基本方法结构和性质都发生变化
5、结构和性质都发生变化沉淀不再溶解于水沉淀不再溶解于水蛋白质的沉淀第8页/共20页蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固凝固。不可逆变性状态不可逆变性状态蛋白质的凝固蛋白质的凝固第9页/共20页蛋白质变性、沉淀与凝固的关系变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属于一种现象于一种现象变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀近才沉淀变性蛋白易于沉淀，变性蛋白易于沉淀，沉淀蛋白不一定变性沉淀蛋白不一定变性沉淀的变性蛋白质也不一定凝固沉淀的变性蛋白质也不一定凝固第10页/共20页蛋白质的加热变性凝固
6、蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化，疏水基团暴露于分子表面，溶解度降低。当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下），则蛋白质发生聚集出现沉淀；当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下），则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀；第11页/共20页实验内容 取三只小玻璃试管，各加入取三只小玻璃试管，各加入10%10%蛋白质溶液蛋白质溶液10d10d，分别标记为分别标记为1 1、2 2和和3 3号管；号管；1.1.向向1 1号管号管中加入：中加入：pH4.8pH4.8缓冲液缓冲液10d10d 。混匀，于酒精。混匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（灯上缓慢加热至沸点，观察变化（）；）；高温下，蛋白质发生不
7、可逆的变性并凝固。高温下，蛋白质发生不可逆的变性并凝固。第12页/共20页2.2.向向2 2号管号管中加入：中加入：H H2 2O 8d,0.1mol/L HCl 2dO 8d,0.1mol/L HCl 2d。混匀，。混匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（）停止加热，向停止加热，向2 2号管号管中中逐滴逐滴加入：加入：0.1mol/L NaCO0.1mol/L NaCO3 3 。摇匀后继续滴加，摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停止。一旦出现絮状物即停止。将将2 2号管号管于酒精灯上加热，观察现象（于酒精灯上加热，观察现象（）冷却后，再加入：冷却后，再加入
8、：0.1mol/L HCl 2d0.1mol/L HCl 2d。观察现象（。观察现象（）蛋白质变性不一定出现沉淀；蛋白质变性不一定出现沉淀；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀；沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。第13页/共20页3.3.向向3 3号管号管中加入：中加入：H H2 2O 8d,0.1mol/L NaOH 2dO 8d,0.1mol/L NaOH 2d。混。混匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（）；）；停止加热，向停止加热，向3 3号管号管中中逐滴逐滴加入：加入：0.1mol/
9、L HAC0.1mol/L HAC。一旦出现絮状物即停止。一旦出现絮状物即停止。继续滴加：继续滴加：0.1mol/L HAC 1d0.1mol/L HAC 1d。观察现象（。观察现象（）将将3 3号管号管于酒精灯上加热，观察现象（于酒精灯上加热，观察现象（）向向3 3号管中加入：号管中加入：0.1mol/L NaOH 0.1mol/L NaOH。一旦出现絮状。一旦出现絮状物即停止。物即停止。将将3 3号管号管于酒精灯上加热，观察现象（于酒精灯上加热，观察现象（）冷却后，再加入：冷却后，再加入：0.1mol/L NaOH 2d0.1mol/L NaOH 2d。观察现象。观察现象（）蛋白质变性不一
10、定出现沉淀；蛋白质变性不一定出现沉淀；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆；蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆；第14页/共20页蛋白质沉淀反应蛋白质的盐析l l一定浓度中性盐一定浓度中性盐 （(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4等）可去除蛋白质分子所等）可去除蛋白质分子所带电荷及其表面的水化层，从而带电荷及其表面的水化层，从而使蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。使蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋白质从溶液中利用这个原理使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法为沉淀出来的方法为盐析盐析。l l不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，
11、可以通过不同浓度盐溶液不同，可以通过不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分离不同蛋白质，就是分段盐析分段盐析。l l大部分蛋白质都可用大部分蛋白质都可用饱和饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4溶液盐析出来。溶液盐析出来。l l某些蛋白质在某些蛋白质在半饱和半饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4溶溶液中析出。液中析出。l l盐析是一个盐析是一个可逆沉淀反应可逆沉淀反应。第15页/共20页实验内容取一只小玻璃试管，加入取一只小玻璃试管，加入2mL2mL蛋白质溶液；蛋白质溶液；加入等体积加入等体积饱和饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4溶液，混匀后静置溶液，混匀后静置3min3
12、min。观察现象（。观察现象（）对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中，对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中，取部分转入另一只试管中；取部分转入另一只试管中；向一只试管中加入向一只试管中加入结晶结晶(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4粉末粉末，直到粉末，直到粉末不再溶解（成为不再溶解（成为饱和饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4溶液）；溶液）；比较两只试管现象（比较两只试管现象（）第16页/共20页蛋白质沉淀反应重金属盐沉淀蛋白质l l在碱性条件下，重金属离子与蛋在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶性蛋白盐而沉淀。白质结合成不溶性蛋白盐而沉淀。实验内容实验内容实
13、验内容实验内容取一只小玻璃试管，加入取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液；蛋白质溶液；加入加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀；，混匀；逐滴加入逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。，摇匀，直至出现沉淀为止。第17页/共20页蛋白质沉淀反应生物碱试剂沉淀蛋白质l l在酸性条件下，蛋白质可与生物在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸如苦味酸、钨酸、鞣酸)以以及某些酸及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、如三氯醋酸、过氯酸、硝酸硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，此结合成不溶性的盐沉淀，此时蛋白质带正电荷易于与酸根负时蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。离子结合成盐。实验内容实验内容实验内容实验内容取一只小玻璃试管，加入取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液；蛋白质溶液；加入饱和苦味酸加入饱和苦味酸 6d，观察现象（，观察现象（）；）；注意：注意：苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤第18页/共20页 实验记录与实验报告 实验目的；实验原理；仪器、材料和试剂；实验步骤；结果讨论（含数据处理）；第19页/共20页