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1、第1页/共25页第一部分第一部分 :微生物的利用微生物的利用第2页/共25页 大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，几占粪便干重的1/3。常随粪便散布在周围环境中。正常栖居条件下不致病。一些特殊基因型的大肠杆菌对人和动物有致病性。繁殖迅速，培养容易，是生物学上重要的实验材料。第3页/共25页实验目的实验目的:1.进行大肠杆菌的扩大培养2.进行大肠杆菌的分离第4页/共25页(一一)实验设备及用具实验设备及用具1.250mL三角瓶、封口膜和橡皮圈2.培养皿3.接种环4.酒精灯5.有棉塞的试管6.恒温培养箱、超净台、摇床、灭菌锅第5页/共25页第6页/共25页无菌操作的一般流程 实
2、验前 仪器、培养基高压蒸汽灭菌 实验中 防止 杂菌污染 实验后 操作仪器 灭菌 防止菌外泄第7页/共25页 培养基培养基 是是由人工方法配制而成的，专供微生物由人工方法配制而成的，专供微生物或动植物细胞生长繁殖使用的混合营养或动植物细胞生长繁殖使用的混合营养液。另外还需要满足微生物生长对液。另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、二氧化碳及渗透压的要求。氧气、二氧化碳及渗透压的要求。(二二)培养基的配制培养基的配制 LB液体培养基（细菌通用培养基）液体培养基（细菌通用培养基）50mL蛋白胨蛋白胨0.5g,酵母提取物酵母提取物0.25g,氯化钠氯化钠0.5g,水水50mL LB固体平面培养基固体平
3、面培养基 1g琼脂琼脂第8页/共25页1 1计算计算、称量称量2 2溶化溶化3 3调调pHpH：pH7pH76 64 4分装：分装过程中注意不要使培养基沾分装：分装过程中注意不要使培养基沾在试管管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引在试管管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角的量以不超过三角容积起污染。分装三角的量以不超过三角容积的一半为宜。的一半为宜。5 5加封口膜加封口膜6.6.灭菌灭菌 LBLB液体和固体培养基用高压锅高压液体和固体培养基用高压锅高压蒸汽灭菌蒸汽灭菌（1211kg/压力灭菌15分钟）培养基配制步骤培养基配制步骤封口膜：既通气又不使菌进入第9页/共25页（三）（三）大肠杆大
4、肠杆菌的扩大培养和分离的技术菌的扩大培养和分离的技术 1.1.灭菌灭菌2.2.倒平板倒平板3.3.接种并扩接种并扩大培养大培养 4.4.划线分离划线分离5.5.保存保存 LBLB液体和固体培养基及培养皿用高压锅高液体和固体培养基及培养皿用高压锅高压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌（1211kg/2压力灭菌压力灭菌15分分钟）钟）将将LBLB固体培养基倒入灭菌后的培养皿中，固体培养基倒入灭菌后的培养皿中，制备平面培养基制备平面培养基在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养菌，培养12h12h平板划线法平板划线法培养皿倒置，培养皿倒置，37恒温培养恒温培养1224小时小时
5、用接种环取出，用划线法接种在斜面上，用接种环取出，用划线法接种在斜面上，37培养培养24小时，至于小时，至于4冰箱中保存冰箱中保存第10页/共25页 2.倒平板倒平板 灭菌后的培养基在无菌操作台上，酒精灯火焰附近，倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面第11页/共25页紫外灯，过滤风，酒精灯，酒精棉球在火焰旁右手3指拿锥形瓶，2指拿封口膜使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置第12页/共25页注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板
6、。2.灭菌及消毒：倒平板前超净台用紫外灯和过滤风灭菌，倒平板时关闭紫外灯；桌面及人手用酒精棉球消毒。3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作。4.平板冷凝后，要将平板倒置,可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。第13页/共25页4.大肠杆菌的分离大肠杆菌的分离分离方法:划线分离法和涂布分离法 划线分离法 无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线.将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.第14页/共25页第15页/共25页思考1 1、为何
7、要将平板倒置？、为何要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。落培养基，造成污染。2 2、如何检查培养基是否受杂菌的污染？、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。则未受杂菌污染。第16页/共25页 3.3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前
8、都要灼烧为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？接种环？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。4
9、4、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。思考第17页/共25页5.5.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划次从上一次划线的末端开始，能使
10、细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。殖而来的菌落。第18页/共25页二、无菌技术二、无菌技术1.1.无菌操作的目的无菌操作的目的 防止培养基被其他微生物污染防止培养基被其他微生物污染(及避免操作者被微生物感染及避免操作者被微生物感染)第19页/共25页2、无菌技术包括、无菌技术包括(1)(1)将实验器具和培养基：将实验器具和培养基：高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌 (2)(2)接种环接种环(针针)、试管口、试管口:灼烧灼烧 灭菌灭菌 (3)实验操作空间：酒精实验操作空间：酒精+紫外线紫外线 消毒消毒（接种室（接种室(箱箱)、超净工作台）、超净工作台）(4)(4)双手双手:酒精酒精 消毒消毒 (5)实验操作应在实验操作应在 酒精灯火焰酒精灯火焰 旁进行旁进行(6)避免已灭菌处理的材料用具与避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品周围物品 相接触。相接触。第20页/共25页(7)(7)棉塞棉塞(封口膜封口膜):):只让空气通过，而空只让空气通过，而空气中的微生物不能通过。气中的微生物不能通过。灼烧灭菌灼烧灭菌高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅第21页/共25页第22页/共25页第23页/共25页第24页/共25页感谢您的观看。第25页/共25页