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1、实验大肠杆菌的培养和分离什么是培养基？什么是培养基？三角瓶三角瓶培养皿培养皿试管试管液体培养基液体培养基:扩大培养扩大培养,工业生产工业生产。固体培养基固体培养基:分离纯化分离纯化,鉴定菌种鉴定菌种,计数计数,保藏。保藏。凝固剂凝固剂:琼脂琼脂培养基的配制培养基的配制营养成分营养成分功能和来源功能和来源碳源碳源氮源氮源生长因子生长因子水水无机盐无机盐提供提供碳元素碳元素:主要是糖类主要是糖类提供提供氮元素氮元素:蛋白胨、牛肉膏、尿素蛋白胨、牛肉膏、尿素维生素、氨基酸和含氮碱基维生素、氨基酸和含氮碱基H2O,良好的溶剂良好的溶剂NaCl:维持一定的渗透压维持一定的渗透压LB 培养基的配制培养基的
2、配制LB固体培养基固体培养基:蛋白胨蛋白胨 0、5g,酵母提取物酵母提取物 0、25g,氯化钠氯化钠 0、5g,加水加水50 mL,琼脂琼脂 1g。调节调节pH 至至7、6。封口膜封口膜菌落菌落:单细菌的克隆单细菌的克隆菌落菌落:在在固体培养基固体培养基上上,由由单个细菌单个细菌繁殖而来的一个肉繁殖而来的一个肉眼可见的具有特定形状的眼可见的具有特定形状的子细胞群体子细胞群体。霉菌霉菌大肠杆菌大肠杆菌菌落的作用菌落的作用:鉴定菌种的重要依据鉴定菌种的重要依据菌落特征菌落特征:菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌:革兰氏阴性、兼性
3、厌氧的肠道杆菌。革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。如何无菌操作？如何无菌操作？高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌:培养皿培养皿、试管、试管、三角瓶三角瓶、枪头、枪头、玻璃三角玻璃三角刮刀刮刀、接种环接种环、镊子。、镊子。在在121下灭菌下灭菌15 min。高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅培养皿培养皿三角瓶三角瓶玻璃三角刮刀玻璃三角刮刀接种环接种环微量移液器微量移液器枪头枪头棉花塞、封口膜、牛皮纸或旧报纸、橡皮筋棉花塞、封口膜、牛皮纸或旧报纸、橡皮筋不能用脱脂棉不能用脱脂棉:易吸水易吸水,容易引起污染。容易引起污染。酒精灯和酒精棉球酒精灯和酒精棉球灭菌灭菌:杀死所有微生物。杀死所有微生物。消毒消毒:杀死部分微生
4、物杀死部分微生物(不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子)。超净工作台超净工作台打开紫外灯和过滤风打开紫外灯和过滤风,灭菌灭菌30 min。点燃酒精灯点燃酒精灯酒精棉擦拭桌面酒精棉擦拭桌面酒精棉球擦手。酒精棉球擦手。酒精灯火焰附近旁进行酒精灯火焰附近旁进行灼烧灭菌灼烧灭菌防止杂菌污染防止杂菌污染用细菌过滤器除菌用细菌过滤器除菌:尿素加热会分解尿素加热会分解,用用G6玻璃砂漏玻璃砂漏斗斗过滤。过滤。什么是倒平板？什么是倒平板？将灭菌后的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中将灭菌后的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中,冷却凝固后制冷却凝固后制成的培养基。成的培养基。Step1:培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌
5、将将50 mL LB液体培养基液体培养基、50 mL LB固体培养基固体培养基和培养和培养皿进行皿进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌。无菌水无菌水培养皿用牛皮纸包扎培养皿用牛皮纸包扎Step2:倒平板倒平板在酒精灯火焰旁在酒精灯火焰旁将三角瓶中的将三角瓶中的固体培养基固体培养基(冷却到冷却到60)倒入灭菌的培养皿中倒入灭菌的培养皿中,置于水平放置上置于水平放置上,并并轻轻晃动轻轻晃动,待待凝固凝固后形成平面。后形成平面。超净台超净台Step3:接种后扩大培养接种后扩大培养将将斜面斜面上培养的大肠杆菌菌种上培养的大肠杆菌菌种接种接种到到灭菌后的液灭菌后的液体培养基体培养基中中,使其在使其在37摇床培养
6、摇床培养12 h。恒温摇床恒温摇床Step4:平板划线分离平板划线分离用用接种环接种环在培养大肠杆菌的三角瓶中在培养大肠杆菌的三角瓶中蘸取菌液一次蘸取菌液一次,在在固体培养基的固体培养基的平板上连续划线平板上连续划线。将。将培养皿倒置培养皿倒置,放在放在37 恒温箱中恒温箱中培养培养1224 h。如何在平板上划线？如何在平板上划线？1次次2次次3次次4次次连续划线法连续划线法分区划线法分区划线法原因原因:随着随着划线次数的增加划线次数的增加,菌数越来越少菌数越来越少,最终在划线的最终在划线的末端出现由一个细菌繁殖而来的末端出现由一个细菌繁殖而来的单个菌落单个菌落。为什么通过划线分离可得到单菌落
7、？为什么通过划线分离可得到单菌落？原因原因:既能够使培养基表面的既能够使培养基表面的水分更好地挥发水分更好地挥发,又能够防止又能够防止皿盖上的水珠落入培养基皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。中造成污染。恒温培养时培养皿倒置恒温培养时培养皿倒置培养皿倒置培养皿倒置皿盖皿盖皿底皿底恒温培养箱恒温培养箱Step5:菌种的斜面保存菌种的斜面保存将接种环将将接种环将单菌落单菌落取出取出,用划线法接种在用划线法接种在斜面培养基斜面培养基上上,37培养培养24 h后后,置于置于4冰箱冰箱中保存。中保存。斜面培养基斜面培养基试管斜面培养基的制作试管斜面培养基的制作方法方法:将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中
8、将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中,灭菌后灭菌后将将试管斜放试管斜放,令其冷却令其冷却,固体培养基即成为固体培养基即成为斜面斜面。平板划线分离法平板划线分离法灼烧接种环灼烧接种环外焰外焰先灼烧后冷却先灼烧后冷却:以免接种环温度太高以免接种环温度太高,杀死菌种。杀死菌种。接种环冷却后接种环冷却后,蘸取带菌培养物蘸取带菌培养物在近火焰处在近火焰处,让带菌接种环在固体培养让带菌接种环在固体培养 基上划线基上划线恒温培养箱中倒置培养恒温培养箱中倒置培养分区划线法分区划线法每次划线之前都要灼烧接种环。每次划线之前都要灼烧接种环。总是从上一次划线的末端开始划线。总是从上一次划线的末端开始划线。稀释涂布分
9、离法稀释涂布分离法用用无菌吸管无菌吸管吸取吸取1mL细菌培养液细菌培养液加入另一个盛有加入另一个盛有9mL无菌水无菌水的试管中的试管中,混合均匀混合均匀,以此制成以此制成10-1倍倍的稀释液。的稀释液。梯度稀释菌液梯度稀释菌液:10-510-7倍倍滴加菌液滴加菌液用用无菌吸管无菌吸管取取0、1mL稀释度不同的菌液稀释度不同的菌液,加在培养加在培养皿的固体培养基上。皿的固体培养基上。用玻璃刮刀涂布用玻璃刮刀涂布玻璃涂棒玻璃涂棒将将玻璃刮刀玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧放在酒精灯火焰上灼烧,待玻璃刮刀冷却后待玻璃刮刀冷却后,在酒在酒精灯旁打开培养皿精灯旁打开培养皿,将将菌液涂布菌液涂布到整个培养基表
10、面。到整个培养基表面。将培养皿倒置将培养皿倒置,在在37恒温箱中培养恒温箱中培养2448 h。恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养恒温培养箱恒温培养箱结果结果:以每个培养皿中有以每个培养皿中有20个以内的个以内的单菌落单菌落最为合适。最为合适。10-110-210-310-410-5倒平板倒平板平板划线分离平板划线分离练一练练一练,识一识识一识稀释涂布分离稀释涂布分离接种环接种环玻璃刮刀玻璃刮刀例题例题:要获得遗传特性单一的要获得遗传特性单一的大肠杆菌菌种大肠杆菌菌种,一般必须对原有一般必须对原有的大肠杆菌菌种进行的大肠杆菌菌种进行扩大培养扩大培养,并利用并利用纯化技术纯化技术得到得到单菌落单菌落
11、的菌种的菌种。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实验的相关。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实验的相关问题问题:(1)对买回来的大肠杆菌菌种进行对买回来的大肠杆菌菌种进行扩大培养扩大培养,一般用一般用LB培养培养基基,在培养基中为微生物提供在培养基中为微生物提供碳源、氮源和能源碳源、氮源和能源的物质主要的物质主要是是,为为调节渗透压调节渗透压,要加入一定量的要加入一定量的。为进行大肠杆菌的。为进行大肠杆菌的分离分离,还要加入还要加入 配制成固体培养基配制成固体培养基,并进行并进行倒平板倒平板的操作。的操作。蛋白胨和酵母提取物蛋白胨和酵母提取物氯化钠氯化钠琼脂琼脂(2)获得获得纯净微生物培养物
12、纯净微生物培养物的关键是的关键是,为此为此,必须对培养必须对培养器皿、接种用具器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培养器和培养基进行严格灭菌。培养器皿和培养基一般采纳皿和培养基一般采纳 法灭菌法灭菌,接种环采纳接种环采纳灼烧法灼烧法灭菌灭菌。同时在。同时在接种或倒平板接种或倒平板操作时操作时,除了在超净台上进行操除了在超净台上进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和消毒外作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和消毒外,还必须还必须 以防止空气中的杂菌污染。以防止空气中的杂菌污染。(3)大肠杆菌菌种的大肠杆菌菌种的扩大培养扩大培养一般采纳液体培养基一般采纳液体培养基,接种后将接种后将培养基置于培养基置于37摇床振荡摇床振荡条件下培养条件下培养12 h。菌种的。菌种的分离分离一般一般在固体培养基上采纳在固体培养基上采纳法法,并将培养皿以并将培养皿以状态放状态放置于适宜温度的恒温箱中置于适宜温度的恒温箱中,培养培养1224 h后后,接种于接种于固体斜面培养基固体斜面培养基上上,37培养培养24 h后后,得到的纯化菌种得到的纯化菌种在在条件下条件下保存保存。防止被杂菌污染防止被杂菌污染高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌保证操作过程在酒精保证操作过程在酒精灯火焰旁进行灯火焰旁进行划线分离划线分离倒置倒置将单菌落用接将单菌落用接种环取出种环取出4感谢您的聆听！感谢您的聆听！