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1、会计学1实验实验2分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物2一一一一.实验原理实验原理实验原理实验原理 尿素尿素 NH3 中性中性 碱性碱性 酚红颜色：酚红颜色：(酸性)黄色黄色 红色红色(变色范围变色范围 pH6.4-8.2)pH6.4-8.2)第1页/共13页二二.实验目的实验目的 使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶有脲酶)通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pHpH的变化的变化(脲酶催化的化学反应脲酶催化的化学反应)第2页/共13页三三.实验步骤实验步骤.倒平板倒平板.制备一定浓度梯度的细菌悬液
2、制备一定浓度梯度的细菌悬液g g土壤土壤mlml无菌水，振荡，为无菌水，振荡，为-2-2稀释液，依次制备稀释液，依次制备-3-3、-4-4、-5-5的土壤稀释液。的土壤稀释液。.稀释涂布分离法分离细菌稀释涂布分离法分离细菌.制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基P26P26.培养观察培养观察（倒置，（倒置，37 24-48h37 24-48h）（无菌，0.1ml，玻璃刮刀）第3页/共13页配制培养基配制培养基配制培养基配制培养基n n尿素培养基尿素培养基尿素培养基尿素培养基 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 0.025g0.025g0.025g0.025g NaCl
3、0.12g NaCl 0.12g NaCl 0.12g NaCl 0.12g K K K K2 2 2 2HPO4 0.12g HPO4 0.12g HPO4 0.12g HPO4 0.12g 琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖 0.5g0.5g0.5g0.5g 酚红酚红酚红酚红 0.25g0.25g0.25g0.25g 尿素尿素尿素尿素 10ml10ml10ml10mlLBLB培养基培养基 蛋白胨：蛋白胨：0.25g0.25g 酵母提取液：酵母提取液：0.12g0.12g NaCl NaCl：0.25g0.25g 琼脂糖琼脂糖：0.5g 0.5g 对照组对照组选择培养基选择培养基实验组实验组为什么用琼
4、脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？第4页/共13页接种接种n n取0.1ml菌悬液第5页/共13页涂布分离涂布分离第6页/共13页涂布分离涂布分离第7页/共13页37倒置培养倒置培养按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞恒温恒温37培养培养第8页/共13页1 1 1 1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基n n因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量因为琼脂
5、是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的
6、筛选，的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂思考题：第9页/共13页2 2 2 2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用n n土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨使土壤碱化，氨还与氨使土壤碱化，氨还与氨使土壤碱化，氨还与氨使土壤碱化，氨还
7、与SOSOSOSO4 4 4 42-2-2-2-等离子形成化合等离子形成化合等离子形成化合等离子形成化合物，使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物，使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物，使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物，使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物尸体降解，而且利用了所形成的氨，有利物尸体降解，而且利用了所形成的氨，有利物尸体降解，而且利用了所形成的氨，有利物尸体降解，而且利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。于自然界中氮的循环。于自然界中氮的循环。于自然界中氮的循环。第10页/共13页3 3 3 3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色
8、的环带出现。、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。n n细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚酞在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸为碱性，酚酞在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸为碱性，酚酞在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸为碱性，酚酞在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲
9、酶水解尿素的作碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。第11页/共13页4 4 4 4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落基上只有少数菌落基上只有少数菌落基上只有少数菌落 n n表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极少数。表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极少数。表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极少数。表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极少数。5.5.本实验分离出来的细菌一定都是以尿素为氮源的细菌吗？本实验分离出来的细菌一定都是以尿素为氮源的细菌吗？不一定，有些细菌能利用其它微生物的代谢产物不一定，有些细菌能利用其它微生物的代谢产物。第12页/共13页