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1、实验实验2 分离以分离以尿素尿素为为氮源氮源的微生物的微生物尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源 从功能上是从功能上是选择培养基选择培养基 实验目的：实验目的：1.使用专一的培养基（使用专一的培养基（尿素尿素为唯一氮源为唯一氮源）分）分离专一的细菌（有离专一的细菌（有脲酶脲酶的细菌，脲酶是胞外的细菌，脲酶是胞外酶）。酶）。2.使用使用指示剂指示剂（酚红酚红）颜色的变化检知酶颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。（脲酶）所催化的反应。 实验原理：实验原理：脲脲即即尿素尿素，是，是蛋白质降解蛋白质降解的产物。的产物。人和其他哺乳人和其他哺乳动物尿中都含有尿素，动物尿中都含有尿素，有一些细菌有一些细菌分泌分
2、泌脲酶脲酶可以可以分分解尿素解尿素，利用尿素作为其生长的，利用尿素作为其生长的氮源氮源。(NH2) 2C=O+H2O 2NH3+CO2脲酶脲酶酚红酚红在酸性环境里为在酸性环境里为黄黄色，在碱性环境中为色，在碱性环境中为红红色。色。若加入酚红，有脲酶的细菌菌落周围可观察到？若加入酚红，有脲酶的细菌菌落周围可观察到？出现红色环状区域出现红色环状区域。其大小其大小代表代表脲酶活性的强弱脲酶活性的强弱和和含量的多少含量的多少。区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。不用酚红能否分离得到以尿素为氮源的细菌？不用酚红能否分离得到以尿素为氮源的细菌？能，酚红起能，酚红起进
3、一步鉴定进一步鉴定的作用。的作用。从土壤中从土壤中分离分离出能利用尿素的细菌，出能利用尿素的细菌，观观察菌落数察菌落数，了解它在生态平衡中的作用。，了解它在生态平衡中的作用。 怎么对照？怎么对照？ 与与LB全营养全营养培养基培养基做对照。做对照。 实验实验内容内容：划线分离法划线分离法涂布分离法涂布分离法本实验所用，单菌落更易分开，本实验所用，单菌落更易分开，但操作复杂些（要稀释）但操作复杂些（要稀释）,还可还可以计数以计数方法简单。方法简单。1. 250mL的三角瓶的三角瓶1个、个、100 mL的三角瓶的三角瓶2个个2. 有盖试管有盖试管5支（支（15mm150mm）、试管架）、试管架3.
4、培养皿培养皿4个个4. 超净台超净台5. 移液器移液器/取样器取样器6. 玻璃刮刀玻璃刮刀7. 酒精灯酒精灯8. 200mL烧杯烧杯1个个 设备及用品：设备及用品： 实验材料：实验材料：（1）25mL全营养全营养LB固体培养基：固体培养基：蛋白胨蛋白胨 0.25g、酵母提取物、酵母提取物 0.12g、NaCl 0.25g、琼脂糖琼脂糖 0.5g，加水至，加水至 25ml。（2）25mL尿素固体培养基尿素固体培养基：葡萄糖葡萄糖 0.025g、NaCl 0.12g、K2HPO4 0.12g、琼脂糖琼脂糖 0.5g、酚红酚红 0.25mg，加水至，加水至 15mL。加封口膜灭菌。加封口膜灭菌。怎么
5、灭菌？怎么灭菌？尿素在高温下会分解？尿素在高温下会分解？500g/cm2压力压力（90以上）以上）灭菌灭菌30min灭菌冷却到灭菌冷却到60时，加入时，加入经经G6玻璃漏斗过滤玻璃漏斗过滤（使其（使其无菌无菌）的）的尿素溶液尿素溶液，摇动，混合均匀后待用。，摇动，混合均匀后待用。琼脂是未被纯化的混合物琼脂是未被纯化的混合物,内含一定量的含氮化合物内含一定量的含氮化合物提供无机盐，还有维持提供无机盐，还有维持pH相对稳定相对稳定作用作用G6玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗：某溶液通过某溶液通过G6玻玻璃漏斗过滤后形璃漏斗过滤后形成了成了无菌无菌溶液。溶液。用前？用前？P21高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法用后？
6、盐酸浸泡、抽滤去酸用后？盐酸浸泡、抽滤去酸、蒸馏水洗至中性，干燥、蒸馏水洗至中性，干燥其实超净台的过滤风也是过滤除菌法进行的。其实超净台的过滤风也是过滤除菌法进行的。 实验材料：实验材料：（3）土样）土样1g（从有（从有哺乳动物排泄物哺乳动物排泄物的地方取得）的地方取得）1. 配制培养基，灭菌，配制培养基，灭菌，倒平板倒平板2. 制备制备细菌悬液细菌悬液3. 用用涂布分离法涂布分离法分离细菌分离细菌4. 细菌培养细菌培养5. 观察观察 实验步骤实验步骤1.配制培养配制培养基基，灭菌，倒平板。，灭菌，倒平板。将两将两只只三角瓶中已灭菌的三角瓶中已灭菌的LB固体培养基固体培养基和和尿素固体培养基尿
7、素固体培养基，在，在60左右时，在左右时，在酒精酒精灯灯旁分别倒入旁分别倒入两两个培养皿中，在个培养皿中，在水平的水平的超超净台净台上上摇匀，平放至凝固摇匀，平放至凝固。 实验步骤实验步骤2.制备制备细菌悬液细菌悬液。如何获得如何获得稀释度稀释度不同的菌液？不同的菌液？依次制备依次制备10-3、10-4、10-5土壤稀释液。尽量土壤稀释液。尽量只取只取悬液悬液，摇匀。，摇匀。在无菌条件下，将在无菌条件下，将1g土壤加到有土壤加到有99mL无菌水无菌水的的三角瓶中，三角瓶中，振荡振荡10min，即成，即成10-2土壤稀释液。土壤稀释液。3.涂布分离法涂布分离法分离分离取取10-4、10-5的土壤
8、稀释液各的土壤稀释液各0.1mL，分别分别加到加到LB培养基和培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精酒精中的中的玻璃玻璃刮刀刮刀放在酒精灯火焰上，待放在酒精灯火焰上，待刮刀刮刀上火焰熄灭，在上火焰熄灭，在酒精灯火酒精灯火焰旁焰旁打开培养皿，将菌液打开培养皿，将菌液涂布涂布到整个平面上。到整个平面上。求平均值，求平均值，以减少误差以减少误差涂布分离涂布分离玻璃三角刮刀玻璃三角刮刀使用前后使用前后都要灭菌都要灭菌处理处理4.将培养皿将培养皿倒置倒置，在，在37恒温箱恒温箱中培养中培养24-48h。观察观察菌落数菌落数。恒温培养箱恒温培养箱5.观察。观察。
9、能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有少数数量能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有少数数量。 尿素固体培养基尿素固体培养基从用途上从用途上看属于看属于？ 为确为确定定尿素是否被分解尿素是否被分解，还还可观察？可观察？LB全营养固体培养基全营养固体培养基上的菌落上的菌落多而杂多而杂尿素固体培养基尿素固体培养基上的菌落上的菌落少而纯少而纯选择培养基选择培养基是否出现红是否出现红色环状区域色环状区域对照问题 思考:1）接种前需要检测培养基是否被污染，该如何检测？2）如何排除接种过程中有没有带入杂菌，细菌培养的对照？3）如何判断尿素固体培养基是否起到了选择作用？将未接种的培养基在适宜温度下倒置放置适宜的时间
10、，观察培养基上是否有菌落产生。往往接种的等量的无菌水，在适宜温度下倒置放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。接种了的LB全营养培养基，在适宜温度下倒置放置适宜的时间，观察培养基上菌落的数量及种类。土样1g 10-5稀释度下取0.1mL计算得50个菌落，则每克土壤中有多少个细菌？土样10g 10-5稀释度下取0.1mL计算得50个菌落，则每克土壤中有多少个细菌？5107个5107个注意：稀释度（稀释倍数的倒数） 稀释倍数琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量
11、的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿不利于以尿素为氮源的细菌的筛选素为氮源的细菌的筛选，故而用经纯化的琼脂糖，故而用经纯化的琼脂糖而不用琼脂作为固化剂。而不用琼脂作为固化剂。课后习题课后习题1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？2.如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，解，水解后的氨使土壤变成碱性水解后的氨使土壤变成碱性，氨与其他阴离子如硫，氨与其他阴离子如硫酸根、碳酸根、硝
12、酸根等形成化合物，则酸根、碳酸根、硝酸根等形成化合物，则会使土壤板结会使土壤板结。有有脲酶的细菌脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，所形成的氨，有利于自然界中有利于自然界中氮的循环氮的循环。3.细胞向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，细胞向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素尿素水解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里为黄色，水解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里为黄色，在碱性环境里变成红色。在碱性环境里变成红色。培养基中的酸碱指示剂产生培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，颜色变化（变红），标
13、志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明了这一菌株可以以尿素为氮源。从而证明了这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，代表菌株利用尿素的能力越强。域越大，代表菌株利用尿素的能力越强。4.这一现象表明这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数数量极少数数量。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，每人每天排泄约竟是少量的，每人每天排泄约500-800mL尿，但随地便尿，但随地便溺的不多，动物虽然随地便溺，但尿素
14、还是可以在高溺的不多，动物虽然随地便溺，但尿素还是可以在高温下自然分解的，因此，以尿素为氮源的菌群较少。温下自然分解的，因此，以尿素为氮源的菌群较少。思考：思考：实验中尿素培养基上分离出来的细菌肯定实验中尿素培养基上分离出来的细菌肯定都是都是以尿以尿素为氮源吗？素为氮源吗？不一定。不一定。自然界还存在自然界还存在自生固氮菌自生固氮菌，可以利用空气中的氮气。，可以利用空气中的氮气。3、选择选择培养基培养基 苯酚苯酚 为为唯一碳源唯一碳源 A 涂布分离法涂布分离法 有无苯酚有无苯酚 涂布分离涂布分离 避免培养过程凝结成的水滴落在菌落上，菌落随水扩散，达不避免培养过程凝结成的水滴落在菌落上，菌落随水
15、扩散，达不到分离形成到分离形成单菌落单菌落的目的的目的4. （1）达到设定的温度或压力）达到设定的温度或压力 抽滤抽滤（2）C 水解圈直径与菌落直径水解圈直径与菌落直径上清液（悬浮液）上清液（悬浮液）5.（1）琼脂（）琼脂（2）先调）先调pH，后灭菌，后灭菌 （3）选择）选择 硝酸铵硝酸铵 （4）芽芽孢孢（5）20mg/L氯苯氯苯 SP1菌株是以氯苯为碳源，菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌当氯苯消耗尽菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早菌株越早停止生长停止生长6、琼脂、琼脂糖糖 葡萄糖葡萄糖 尿素尿素 选择选择 异养型异养型
16、抽滤是一个物理术语，又称减压过滤，物理抽滤是一个物理术语，又称减压过滤，物理术语中抽滤术语中抽滤 (Leaching)指利用抽气泵使抽指利用抽气泵使抽滤瓶中的压强降低滤瓶中的压强降低7、（、（2）涂布分离）涂布分离 高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅 紫外线和过滤紫外线和过滤风风（3）碳源和氮源）碳源和氮源 （4）大小）大小8、灭菌、灭菌 消毒消毒 灭菌灭菌 将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生观察培养基上是否有菌落产生.尿素尿素 酚红酚红 涂布分离涂布分离 红红 C9. 脲酶脲酶 红红 （2）D （3）接种接种 涂布
17、涂布 单单（4） 恒温培养箱恒温培养箱 无法形成单菌落（无法形成单菌落（5）尿素尿素10. 1.63109 纤维素被分解纤维素被分解 4（10分）人和哺乳动物的尿中含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源。现对土壤中的这类细菌进行分离实验，请回答下列问题：（1）尿素固体培养基的凝固剂是 。（2）此实验常用玻璃刮刀在固体培养基上采用 法进行分离，此分离方法的优点是 。（3）判断尿素固体培养基是否起到选择分解以尿素为氮源的细菌，应该设置的对照是 ( )A未接种的尿素固体培养基 B未接种的LB全营养培养基C接种了的尿素固体培养基 D接种了的LB
18、全营养培养基（4）若培养基中存在有脲酶的细菌，其菌落周围会出现 ，这是由于尿素被分解产生氨，遇培养基中加入的 指示剂产生的颜色变化，从而证明这一菌株可以尿素为氮源。利用尿素的细菌在生态平衡中的作用是 。 （5）有人取土样10g加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1ml，转至9ml的无菌水的大试管中，依次稀释到10-5稀释度，将该稀释度取0.1ml进行一定方法分离，得到10个某种细菌的菌落，则可估算每克土样中的该细菌数是 A1106 B.1107 C.1108 D.1109更易得到单菌落，且可以计数更易得到单菌落，且可以计数D红色环红色环状区域状区域酚红酚红维持氮平衡
19、维持氮平衡B5（10分）.土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为生长的氮源，现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验基本步骤如下：请回答下列问题：（2）A是 。制备A时，应在无菌条件下，将1g土样（从有 的地方取得）加到有无菌水中进行稀释获得土壤稀释液，从而制备10-4、10-5的土壤稀释液。取样时，尽量只取 。（3）用X法分离细菌时，通常取10-4、10-5的土壤稀释液各 mL，在 旁进行X法分离，为了减少实验误差，通常采取的措施是 。（4）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入指示剂的目的是 ( ) A对分离的菌种作进一步的鉴定 B筛选出能分解尿素的细菌 C培养基中以指示剂作为细菌的营养 D如
20、指示剂变黄我们就能准确地认定该菌能分解尿素细菌悬液细菌悬液悬液悬液0.1酒精灯火焰酒精灯火焰各个浓度做各个浓度做3个培养皿个培养皿A1.（1）制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取）制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用_蘸取少量的稀释蘸取少量的稀释液，在液，在 MRS 乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。下图所示的划线分离操作，正确的是落。下图所示的划线分离操作，正确的是_。（2）泡菜腌制过程中，会产生有机酸、醇类和亚硝酸盐，其中醇）泡菜腌制
21、过程中，会产生有机酸、醇类和亚硝酸盐，其中醇类是由类是由_进行厌氧呼吸产生。亚硝酸盐对人体有害，为测定进行厌氧呼吸产生。亚硝酸盐对人体有害，为测定泡菜中亚硝酸盐含量，从泡菜中提取亚硝酸盐，与泡菜中亚硝酸盐含量，从泡菜中提取亚硝酸盐，与_发生重发生重氮化反应，再与氮化反应，再与 N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物。然后用萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物。然后用光程为光程为 1cm 的的_，在，在 550nm 光波下测定光密度值，与由光波下测定光密度值，与由已知浓度梯度亚硝酸钠制作的已知浓度梯度亚硝酸钠制作的_比对，计算样品中亚硝比对，计算样品中亚硝酸盐的含量。酸盐的含量。（3）已知乳酸菌中的亚
22、硝酸还原酶能降解亚硝酸盐。在一定的腌）已知乳酸菌中的亚硝酸还原酶能降解亚硝酸盐。在一定的腌制时间内，随着腌制时间的延长，泡菜中亚硝酸盐含量逐渐降低制时间内，随着腌制时间的延长，泡菜中亚硝酸盐含量逐渐降低，是由于在厌氧和，是由于在厌氧和_环境下亚硝酸盐被亚硝酸还原酶降解。环境下亚硝酸盐被亚硝酸还原酶降解。（3）已知葡萄糖与蒽酮试剂反应能产生颜色）已知葡萄糖与蒽酮试剂反应能产生颜色,采用光电比色法测定红曲酒中的葡萄糖含量的采用光电比色法测定红曲酒中的葡萄糖含量的步骤如下步骤如下:第一步第一步,标准曲线的制作。用蒸馏水标准曲线的制作。用蒸馏水配置配置_,与蒽酮试剂反应后与蒽酮试剂反应后,用比色计用比
23、色计测定测定,并制作以并制作以_的标准曲线。第二的标准曲线。第二步步,样品处理。将待测酒样品通过活性炭脱色样品处理。将待测酒样品通过活性炭脱色,其目的是其目的是_。第三步。第三步,样品测定与计样品测定与计算。算。一系列浓度的葡萄糖标准溶液一系列浓度的葡萄糖标准溶液 葡萄糖浓度与光密度值关系葡萄糖浓度与光密度值关系排除原有颜色的干扰偏小已知氨和纳氏试剂反应生成淡红色络合物，用光已知氨和纳氏试剂反应生成淡红色络合物，用光程程1cm的比色杯在的比色杯在570nm处可测定光密度值，若处可测定光密度值，若光密度值偏低，则应选择光密度值偏低，则应选择_光程，光程，光波长光波长_。(1)脂氨酸的含量可以通过
24、让其与相应试剂反应并显色后,用 _（填仪器名称）测定其OD值来测定。测定OD值前，需要通过预实验确定所需比色杯的_，脂氨酸的含量相同时,比色杯的该指标越大所测得的OD值越_。可以通过OD值来确定脂氨酸含量的原理是_。分光光度计分光光度计/光电比色计光电比色计/比色计比色计脯氨酸含量越高，显色后颜色越深，OD值越大，呈正比例关系越大光程2（09浙江）（浙江）（2）泡菜发酵过程中，会产生多种）泡菜发酵过程中，会产生多种酸，其中主要是酸，其中主要是 ，还有少量的亚硝酸。对亚，还有少量的亚硝酸。对亚硝酸盐的定量测定可以用硝酸盐的定量测定可以用 法，因为亚硝酸盐法，因为亚硝酸盐与对氨基苯磺酸的反应产物能
25、与与对氨基苯磺酸的反应产物能与N-1-萘基乙二胺萘基乙二胺偶联成偶联成 色化合物。色化合物。再通过再通过_（填仪（填仪器名称）测定器名称）测定_值值,进行样品测定时，还要取进行样品测定时，还要取等量水进行同样的测定，目的是等量水进行同样的测定，目的是 。（3）已知葡萄糖与蒽酮试剂反应能产生颜色）已知葡萄糖与蒽酮试剂反应能产生颜色,采采用光电比色法测定红曲酒中的葡萄糖含量的步骤用光电比色法测定红曲酒中的葡萄糖含量的步骤如下如下:第一步第一步,标准曲线的制作。用蒸馏水配置标准曲线的制作。用蒸馏水配置_,与蒽酮试剂反应后与蒽酮试剂反应后,用比色计测定用比色计测定,并并制作以制作以_的标准曲线。第二步
26、的标准曲线。第二步,样品处样品处理。将待测酒样品通过活性炭脱色理。将待测酒样品通过活性炭脱色,其目的是其目的是_。第三步。第三步,样品测定与计算。样品测定与计算。3.(1)脂氨酸的含量可以通过让其与相应试剂反应脂氨酸的含量可以通过让其与相应试剂反应并显色后并显色后,用用 _（填仪器名称）测定其（填仪器名称）测定其OD值来测定。测定值来测定。测定OD值前，需要通过预实验确值前，需要通过预实验确定所需比色杯的定所需比色杯的_，脂氨酸的含量相同，脂氨酸的含量相同时时,比色杯的该指标越大所测得的比色杯的该指标越大所测得的OD值越值越_。可以通过。可以通过OD值来确定脂氨酸含量的原理是值来确定脂氨酸含量
27、的原理是_。4.已知氨和纳氏试剂反应生成淡红色络合物，用光已知氨和纳氏试剂反应生成淡红色络合物，用光程程1cm的比色杯在的比色杯在570nm处可测定光密度值，若光处可测定光密度值，若光密度值偏低，则应选择密度值偏低，则应选择_光程（填增光程（填增大或减小），光波长大或减小），光波长_（填增大或减小或不（填增大或减小或不变）变）。5.人和哺乳动物的尿中含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。人和哺乳动物的尿中含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源。现对土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源。现对土壤中的这类细菌进行分离实
28、验，请回答下列问题：土壤中的这类细菌进行分离实验，请回答下列问题：（1）尿素固体培养基的凝固剂是）尿素固体培养基的凝固剂是 。（2）此实验常用玻璃刮刀在固体培养基上采用）此实验常用玻璃刮刀在固体培养基上采用 法进行分离，此法进行分离，此分离方法的优点是分离方法的优点是 。（3）判断尿素固体培养基是否起到选择分解以尿素为氮源的细菌，应）判断尿素固体培养基是否起到选择分解以尿素为氮源的细菌，应该设置的对照是该设置的对照是 ( )A未接种的尿素固体培养基未接种的尿素固体培养基 B未接种的未接种的LB全营养培养基全营养培养基C接种了的尿素固体培养基接种了的尿素固体培养基 D接种了的接种了的LB全营养培
29、养基全营养培养基（4）若培养基中存在有脲酶的细菌，其菌落周围会出现）若培养基中存在有脲酶的细菌，其菌落周围会出现 ，这是，这是由于尿素被分解产生氨，遇培养基中加入的由于尿素被分解产生氨，遇培养基中加入的 指示剂产生的颜色变指示剂产生的颜色变化，从而证明这一菌株可以尿素为氮源。利用尿素的细菌在生态平衡化，从而证明这一菌株可以尿素为氮源。利用尿素的细菌在生态平衡中的作用是中的作用是 。 （5）有人取土样）有人取土样10g加入盛有加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液无菌吸管吸取上清液1ml，转至，转至9ml的无菌水的大试管中，依次稀释到的无菌
30、水的大试管中，依次稀释到10-5稀释度，将该稀释度取稀释度，将该稀释度取0.1ml进行一定方法分离，得到进行一定方法分离，得到10个某种细个某种细菌的菌落，则可估算每克土样中的该细菌数是菌的菌落，则可估算每克土样中的该细菌数是 A1106 B.1107 C.1108 D.1109默写默写分离细菌的方法有分离细菌的方法有_和和_，其，其中后者单菌落更易分开。中后者单菌落更易分开。细菌通过的培养基是细菌通过的培养基是_培养基，该培培养基，该培养基中含有的物质有养基中含有的物质有_ _、NaCl和水和水。其中液体培养基通常用于细菌的。其中液体培养基通常用于细菌的_._ _是消除污染杂菌的通用方法。是
31、消除污染杂菌的通用方法。各种器皿通常用各种器皿通常用_ _方法灭菌，达方法灭菌，达到的温度和压力分别是到的温度和压力分别是 和和 _。尿素溶液要去除杂菌，用尿素溶液要去除杂菌，用_过滤。过滤。填空中的问题填空中的问题新陈代谢类型：异养兼性厌氧型新陈代谢类型：异养兼性厌氧型划线分离法划线分离法 优点是操作简单优点是操作简单2（5）B3（3）浑浊（沉淀）浑浊（沉淀)5 果酒发酵反应式？果酒发酵反应式？ 装水弯曲的目的是？装水弯曲的目的是？6（4）果醋制作）果醋制作 醋酸生成的反应式？醋酸生成的反应式？填图？填图？pH测定测定固体培养基？固体培养基？液体培养基？液体培养基？指示剂，如酚红pH试纸比较
32、：1.LB尿素培养基2.尿素培养基3.LB选择培养基4.以尿素为氮源的LB培养基5、 LB全营养固体培养基6、尿素固体培养基LB全营养培养基、全营养培养基、LB固体培养基固体培养基关键词：尿素（脲）、 哺乳动物排泄物、脲酶、降解、以尿素为氮源 、尿素水解反应式、菌落数、生态平衡、LB固体培养基（LB全营养培养基）作为对照、移移液器、玻璃刮刀、液器、玻璃刮刀、尿素固体培养基、葡萄糖、酚红、琼脂糖、G6玻璃（砂）漏斗过滤、稀释、无菌水、细菌悬液、土壤稀释液、涂布分离法、涂布、菌液、灼烧灭菌法、各浓度做三个培养皿、倒置、恒温培养箱、菌落、红色环状区域注意：尿素（脲） 脲酶【2012浙江高考】浙江高考
33、】17幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：进行分离培养。实验基本步骤如下： 请回答：请回答： （1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为这是因为Hp含有含有 ，它能以尿素作为氮源；若有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落，则菌落周围会出现周围会出现 色环带。色环带。 （2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是 灭菌。灭菌。 A.
34、高压蒸汽高压蒸汽 B.紫外灯照射紫外灯照射 C.70酒精浸泡酒精浸泡 D.过滤过滤 （3）步骤）步骤X表示表示 。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液然后将菌液 到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得得 菌落。菌落。 （4）在培养时，需将培养皿倒置并放在）在培养时，需将培养皿倒置并放在 中。若不中。若不倒置培养，将导致倒置培养，将导致 。 （5）临床上用）临床上用14 C呼气试验检测人体是否感染呼气试验检测人体是否感染Hp，基本原理是，基本原理是Hp能将能将14 C标记的标记的 分解为分解为NH3和和 14 C
35、O2。脲酶脲酶红红D接种接种涂布涂布单单恒温培养箱恒温培养箱无法形成单菌落无法形成单菌落尿素尿素大肠杆菌是革兰氏大肠杆菌是革兰氏_性菌，培养时的温度是性菌，培养时的温度是_，_置放置放在在_（填仪器）中培（填仪器）中培养，若要保存菌种，则需要放在养，若要保存菌种，则需要放在 _冰箱中保存。冰箱中保存。无菌操作时在无菌操作时在_旁操作，在旁操作，在_上操作。上操作。划线分离时由于划线过程中划线分离时由于划线过程中_上的菌液逐渐减上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分细菌间少，因此划线最后部分细菌间_加大，实验时加大，实验时可看到在划线的末端出现可看到在划线的末端出现_，表明菌已，表明菌已被分离。被分
36、离。注意以下名词：高压蒸汽灭菌锅、三角瓶、培养皿、玻璃（三角）刮刀、烘箱、恒温培养箱、摇床、超净台、牛皮纸、封口膜、接种环、LB培养基、琼脂、酵母提取物、蛋白胨 、消毒 灼烧灭菌法 高压蒸汽灭菌法 、1Kg /cm2压力、压力、喷出、 紫外线除菌法、G6玻璃（砂）漏斗过滤、冷却、培养基、 液体培养基 、固体平面培养基（平板）、固体斜面培养基、调节pH 、灭菌 、无菌、接种、菌体、菌液、无菌水划线分离法 稀释 涂布分离法、倒置 、不连续的单菌落37、121、60、4 课后练习课后练习1如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？5+3P230左左下角下角1)胆大心细，胆大
37、心细，操作快捷操作快捷；2)注意注意灭菌操作灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境原则，灭菌彻底，降低环境污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间，对污染源的改善要考虑周到；间，对污染源的改善要考虑周到；3）注意）注意微生物生长条件微生物生长条件，如，如pH、渗透压、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜丰富的物质营养，喜37摄氏度的温度；而霉摄氏度的温度；而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜养，喜25-30摄氏度的温度。因此，知己知摄氏度的温度。因
38、此，知己知彼也可以减少污染。彼也可以减少污染。2.在培养后如何判断是否有杂菌污染？在培养后如何判断是否有杂菌污染？P230右边右边1）从）从菌落的形态菌落的形态看，看，是否湿润、透明、粘稠，是否湿润、透明、粘稠，呈何种颜色呈何种颜色等等，是区别细菌、放线菌和霉菌等等，是区别细菌、放线菌和霉菌的关键指标；的关键指标；2）用）用显微镜镜检观察显微镜镜检观察其形态、大小，其形态、大小，看是否看是否有菌丝、孢子、芽孢等有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵，这也是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌的关键指标；母、放线菌和霉菌的关键指标；3）上述方法较难区分同类的不同物种，需要）上述方法较难区分同类的不同物
39、种，需要借助化学方法和进一步的形态观察借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰，如用革兰氏染色法等。氏染色法等。课后练习3课后练习4：实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后所有接触过细菌的器皿都实验完成后所有接触过细菌的器皿都必须先高压必须先高压灭菌后再洗涤灭菌后再洗涤，特别是培养基特别是培养基，有可能被有害杂，有可能被有害杂菌污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜菌污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压蒸汽灭菌。使健康，也污染环境，因此必须高压蒸汽灭菌。使用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再抛弃。对于用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再抛弃。对于取样器的
40、取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤中加洗衣粉洗涤30min30min，再用清水洗净，仍可再用。，再用清水洗净，仍可再用。练习5：如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通大肠杆菌污染？转基因的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨苄青霉素基因。转基因载体（质粒）转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养中生长，而未被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达菌株进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这
41、就保证了转基因工程菌不能被普通（无抗性基因）的大肠杆菌污染。（10分）人和哺乳动物的尿中含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源。现对土壤中的这类细菌进行分离实验，请回答下列问题：（1）尿素固体培养基的凝固剂是 。（2）此实验常用玻璃刮刀在固体培养基上采用 法进行分离，此分离方法的优点是 。（3）判断尿素固体培养基是否起到选择分解以尿素为氮源的细菌，应该设置的对照是 ( )A未接种的尿素固体培养基 B未接种的LB全营养培养基C接种了的尿素固体培养基 D接种了的LB全营养培养基（4）若培养基中存在有脲酶的细菌，其菌落周围会出现 ，这是由于尿
42、素被分解产生氨，遇培养基中加入的 指示剂产生的颜色变化，从而证明这一菌株可以尿素为氮源。利用尿素的细菌在生态平衡中的作用是 。 （5）有人取土样10g加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1ml，转至9ml的无菌水的大试管中，依次稀释到10-5稀释度，将该稀释度取0.1ml进行一定方法分离，得到10个某种细菌的菌落，则可估算每克土样中的该细菌数是 A1106 B.1107 C.1108 D.1109更易得到单菌落，且可以计数更易得到单菌落，且可以计数D红色环红色环状区域状区域酚红酚红维持氮平衡维持氮平衡B5（10分）.土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为生长的氮
43、源，现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验基本步骤如下：请回答下列问题：（2）A是 。制备A时，应在无菌条件下，将1g土样（从有 的地方取得）加到有无菌水中进行稀释获得土壤稀释液，从而制备10-4、10-5的土壤稀释液。取样时，尽量只取 。（3）用X法分离细菌时，通常取10-4、10-5的土壤稀释液各 mL，在 旁进行X法分离，为了减少实验误差，通常采取的措施是 。（4）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入指示剂的目的是 ( ) A对分离的菌种作进一步的鉴定 B筛选出能分解尿素的细菌 C培养基中以指示剂作为细菌的营养 D如指示剂变黄我们就能准确地认定该菌能分解尿素细菌悬液细菌悬液悬液悬液0.1酒精
44、灯火焰酒精灯火焰各个浓度做各个浓度做3个培养皿个培养皿A脲酶参与了氮循环参与了氮循环（或维持氮平衡）（或维持氮平衡）不能不能琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含氮化合物，尿素不是唯一氮源，琼脂是未被纯化的混合物，内含一定的含氮化合物，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物不能选择出只以尿素为氮源的微生物液体液体血细胞计数板血细胞计数板A固定化酶固定化酶写出下列器具或物品灭菌的方法写出下列器具或物品灭菌的方法1. LB液体培养基液体培养基_2. 接种环接种环_3. 无菌水无菌水_4. 玻璃刮刀玻璃刮刀_5. 超净工作台超净工作台_6. 尿素固体培养基尿素固体培养基_7. 外植体外植体
45、_高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法灼烧灭菌法灼烧灭菌法高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法灼烧灭菌法灼烧灭菌法紫外线灭菌，滤过除菌紫外线灭菌，滤过除菌尿素溶液滤过除菌，其它成分高压蒸汽灭菌尿素溶液滤过除菌，其它成分高压蒸汽灭菌消毒消毒归纳：不同灭菌方法的适用对象归纳：不同灭菌方法的适用对象 1. 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法_2. 灼烧灭菌法灼烧灭菌法_3. 紫外线灭菌紫外线灭菌_4. 滤过除菌滤过除菌_不耐高温的溶液不耐高温的溶液 (如尿素溶液如尿素溶液) 、空气、空气接种环、玻璃刮刀、镊子、解剖刀等接种环、玻璃刮刀、镊子、解剖刀等空气、超净工作台的表面空气、超净工作台的表面不含高温易分解成分的培养基、
46、各种器皿不含高温易分解成分的培养基、各种器皿C灭菌消毒消毒灭菌灭菌将未接种的培养基在适宜温度下培养适宜的时间，观察是否有菌落产生将未接种的培养基在适宜温度下培养适宜的时间，观察是否有菌落产生尿素尿素酚红酚红涂布分离涂布分离红红实验步骤实验步骤G6玻璃玻璃漏斗过滤漏斗过滤思考：1.分离以尿素为氮源的微生物时所取的土样最好是怎样的？培养基从用途上说属于什么类型？2.分离以尿素为氮源的微生物接种方法是什么？划线分离法和涂布分离法有何优点？3.该实验为什么还要做LB培养基的配制？4.尿素溶液如何进行灭菌？5.注意：琼脂一般考虑不提供营养物质，只作凝固剂，但本实验为了防止利用氮元素，所以最好用？【pHp
47、H测定测定】固体培养基？固体培养基？液体培养基？液体培养基？指示剂，如指示剂，如酚红酚红pHpH试纸试纸大肠杆菌的分离一定要先扩大培养？大肠杆菌的分离一定要先扩大培养？（2）为获取土壤中的芽孢杆菌，某同学进行了相关实验，操作流程如下图。上图中步骤A为 ，步骤B为 。要判断培养基灭菌是否彻底，可采用的方法是 。（3）下列消毒灭菌方法中，常用于接种环灭菌的是 。 A.70%酒精浸泡 B.紫外线照射 C.灼烧 D.高压蒸汽（4）请分析划线分离法能得到单菌落的原因： 。倒平板倒平板倒置培养倒置培养将未接种的灭菌后的培养基在适宜温度下倒置培养一段时间后观察是否出现菌落将未接种的灭菌后的培养基在适宜温度下
48、倒置培养一段时间后观察是否出现菌落C划线过程中接种环上的菌液逐划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，到划线最后部分细菌渐减少，到划线最后部分细菌间距离加大，经培养后能得到间距离加大，经培养后能得到单菌落。单菌落。涂布分离法的原理：取涂布分离法的原理：取0.1mL稀释度不同的菌稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养，在适当涂布在培养基平面上，然后进行培养，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。 实验步骤实验步骤1.配制培养基，灭菌，倒平板配制培养基，灭菌，倒平板2.制备细菌悬液制备细菌悬液3.用用涂布分离法涂布分离法分离细菌分离细菌4. 将将培养皿培养皿倒置倒置，在，在37恒温培养恒温培养24-48h。5.观察观察（菌落数）（菌落数）2.制备细菌悬液制备细菌悬液1个个99mL无菌水无菌水 2个个4.5mL无菌水无菌水 10-2土壤稀释液土壤稀释液 10-3, 10-4土壤稀释液土壤稀释液 1g土样土样 如何获得如何获得稀稀释度释度不同的不同的菌液？菌液？为什么每个为什么每个浓度做浓度做3个个培养皿？培养皿？