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1、.基因工程 一DNA 连接酶和 DNA 聚合酶的比拟：！成分：蛋白质 2作用部位：催化形成磷酸二脂键即核苷酸与核苷酸之间 3作用过程：DNA 聚合酶：将单个脱氧核苷酸连接成 DNA 长链 DNA 连接酶：将 DNA 片段的末端粘性和平末端 4作用结果：DNA 连接酶：将存在的 DNA 片段连接成重组 DNA,不需要模板 DNA 聚合酶：以一条 DNA 链为模板,形成新的 DNA分子 二DNA 重组的根本工具：1 限制性核酸内切酶：简称限制酶.主要是从原核细胞中纯化出来的.能够特异性识别双链 DNA 分子的某种特定序列如：EcoR识别GAATTC 序列,切出粘性末端.Sma特异性识别 CCCGG
2、G 序列,切出平末端 并且能使每一条链的特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开,大多数限制酶识别序列由 6 个核苷酸组成.2DNA 连接酶：根据酶的来源不同,把酶分为两类：一种是大肠杆菌别离出的 EcoliDNA 连接酶恢复粘性末端,另一种是从 T4 噬菌体别离出的 T4DNA 连接酶 既可以连接平末端又可以连接粘性末端,连接平末端的效率较低 3载体：质粒是常用的载体,质粒是一种裸露的,结构简单,独立于细菌拟核之外,并具有自我复制能力的很小的双链环状 DNA 分子.质粒.的 DNA 分子上有很多限制酶切割位点,供外源 DNA 插入其中.质粒DNA 分子上有独特的标记基因如：四环素抗性基因
3、,氨苄青霉素抗性基因等,供重组 DNA 的鉴定和选择 在基因工程中使用的运载体除质粒外,还有噬菌体的衍生物,动植物病毒等.三,基因工程的根本操作程序：1获取目的基因：目的基因即编码蛋白质的基因人工合成法：以目的基因转录成的 mRNA 为模版合成双链 DNA 的方法和根据的蛋白质的氨基酸序列推测出相应结构基因的核苷酸序列和从自然界已有的物种中别离出来 基因文库：将含有某种生物的不同基因的许多 DNA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因.1.包含一种生物所有的基因的基因文库叫做基因组文库.的一局部基因,这种基因文库叫局部基因文库.3 通过用某种生物发育的某个时期的
4、 mRNA 反转录所产生的 DNA 可以根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因转录的 mRNA,以与基因的表达产物蛋白质等特性获取目的基因 2构建表达载体：基因工程的核心 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用 2 组成：启动子一段特殊的 DNA 片段,位于基因的首端,它是 RNA聚合酶识别和结合的部位,有它才能转录出 mRNA,最终获得所需要的.蛋白质 终止子 一段特殊的 DNA 片段,位于基因的末端,使转录在所需要的地方停止下来 标记基因 为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而使含有目的基因的细胞筛选出来
5、3.将目的基因导入受体细胞：目的基因导入受体细胞,并在受体细胞内维持稳定和表达的过程,叫做转化 将目的基因导入植物细胞：1.农杆菌转化法：农杆菌在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物当植物受伤时,伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物,吸引农杆菌移向这些细胞,这时农杆菌中的 Ti 质粒上的 T-DNA 可转移 DNA转移到受体细胞,并整合到受体细胞的染色体的 DNA 上,这种方法比拟经济有效将包裹在金属颗粒外表的 DNA 打入受体细胞中,使基因与其整合.3.花粉管通道法在植物授粉后,花粉形成的花粉管还未愈合前,减去柱头,然后滴加含目的基因的 DNA,使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞.是一种简单经
6、济的方法 将目的基因导入动物细胞 显微注射法：转基因动物中采用的最多,也是最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法 将含有目的基因的表达载体提纯,使 DNA 浓度保持在 13 微克毫升,然后从雌性动物体内取出卵可在体内受精,也可在体外受精采用显微注射仪进展显微注射,再将注射了目的基因的受精卵,经胚胎早期培养一段时间再移植到雌性动物的输卵管或子宫内.将目的基因导入微生物细胞 1.原核细胞的特点：繁殖快,多为单细胞,遗传物质较少等,早期的基因工程都用原核生物做受体细胞.2.大肠杆菌细胞最常用的转化方法：首先用钙离子处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境 DNA 分子的生理状态 即感受态,处于这个状
7、态的细胞叫感受态细胞再在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA 分子,完成转化过程.目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定才知道.1.检测 DNA 是否插入了目的基因：采用 DNA 分子杂交技术,即将转基因生物的基因组 DNA 提取出来,在含有目的基因的 DNA 片段上用放射性同位素等标记,以此作为探针,使探针与基因组 DNA 杂交,如果显示杂交带,就明确 DNA 已经插入到染色体中 2,检测目的基因是否转录出了 RNA,从转基因生物中提取 RNA,用标记的目的基因做探针,与 mRNA 杂交,显示杂交带,如此目的基因转录出了 mRNA 3,检测基因是否翻译成了蛋白质
8、,从转基因生物体内提取出蛋白质,用相应的抗体做抗体-抗原杂交,假如有杂交带出现,明确目的基因已经形成了蛋白质产品 4,有时要做个体生物学水平的鉴定.三,基因工程的应用实例 1，转基因植物.杀虫基因：Bt 毒蛋白基因,蛋白酶抑制剂基因,淀粉酶抑制剂基因,植物凝集素基因 抗病基因：1.抗病毒:病毒外侨蛋白基因,病毒的复制酶基因 2,抗真菌：几丁质酶基因,抗毒素合成基因 抗逆基因：渗透压调节基因抗盐碱,抗冻蛋白基因抗冻,抗除草剂基因抗除草剂 转基因改良植物的品质 2，转基因动物 用于提高生长速度 用于改善畜产品的品质肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,使乳糖含量降低 用转基因动物生产药物将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起,通过显微注射等方法,导入哺乳动物的受精卵中,使其发育成转基因动物,进入分泌期后可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物,因而称作乳房乳腺生物反响器,如抗血凝酶,血清白蛋白,生长激素,-抗胰蛋白酶