细胞工程学专业复习文件.pdf

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1、1/16 绪论 一细胞工程（Cell Engineering）：（定义）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。分类（包括）:（填空）植物细胞工程和动物细胞工程 植物细胞工程：（定义）以植物细胞组织为差不多单位，在离体条件下进行培养、生殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或制造新物种，或加速生殖植物新个体，或获得有用物质的过程。动物细胞工程：（定义）是依照细胞生物学及工程学原理，定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或

2、特种细胞产品的一门技术。二（填空）细胞学讲的提出：施旺，施莱登（1838 年）2/16 三1902 年，H aberlandt 提出了细胞全能性学讲。第一章 差不多技术 一湿热灭菌：103-137kPa(121-126C),15-30min.二干热灭菌：利用烘箱加热到位 60-180C 三培养基差不多成分：无机盐（大量元素，微量元素），有机成分（激素，植物生长调节剂），水 常用有机成分：糖类（蔗糖），维生素，肌醇，腺嘌呤，氨基酸 激素：生长素（根），细胞分裂素（芽），赤霉素（细胞伸长）四差不多培养基种类：MS,B5,N6,White(P26)（1）高盐平衡培养基：MS 培养基、LS 培养基、B

3、L 培养基、BM 培养基和 ER 培养基。特点：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性；营养丰富；微量元素种类全，浓度高。（2）高硝态氮培养基：B5 培养基，N6 培养基及 SH 培养基等。特点：硝酸钾的含量高，氨态氮的含量低，含有较高的盐酸硫胺素。（3）中盐培养基：H 培养基、Nitsch 培养基、Miller 培养基和Blaydes 培养基。特点：大量元素无机盐约为 MS 的一般，微量元素种类减少而含量增高，维生素种类比 MS 多。3/16（4）低盐培养基：White 培养基、WS 培养基、HE 培养基、改良 Nitsch培养基及 HB 培养基等。特点：无机盐含量

4、低，有机成分含量相对也专门低。五培养基配制：1000ml 母液需 100ml 大量元素(10*),10ml 微量元素(100*)1 培养基母液配制 无机盐按大量元素、微量元素和铁盐 3 部分分不配制。大量元素一般配制成（1020）母液，微量元素和铁盐则配制成（100200）母液。有机成分最好单独配制。配好的母液需贮存于 24冰箱中。植物激素使用的浓度专门低，因此，一般分不配制成 0.1-1mg/L 浓度的溶液。2 培养基制备 制备培养基时是依照实际需要配制，首先按大量元素、微量元素、铁盐及有机成分的顺序，依次吸取各母液的需要量，加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入适当体积的蒸馏

5、水，并称取相应量的蔗糖放入其中溶解，调节 pH 值，加入琼脂，加热使其完全融化，最后用蒸馏水定容并分装。六外植体：指用于离体培养的活的植物组织，器官等材料。4/16 三种来源：1.生长在自然环境下的植物 2.在温室操纵环境条件下生长的植物 3.无菌环境下培养的植物（最优）。第二章 细胞全能性与形态发生 一细胞全能性：（定义）一个细胞所具有的产生完整个体的固有能力称之为细胞的全能性。细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。二细胞脱分化（cell dedifferentiation）：（定义）培养条件下使一个已

6、分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程确实是细胞脱分化。分化细胞 脱分化 分生细胞 再分化 分化细胞 静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。蛋白体的出现和细胞质密度增加被认为是细胞开始脱分化的标志。三细胞分化（Differentiation）：（定义）是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。四极性（polarity）：（定义）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度5/16 差异。五激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的要紧因素。先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂而不利于细胞分化；

7、反之，则有利于细胞分化。假如两者同时处理，则可促使分化频率的提高。六（简答）植物的离体器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。不定根、不定芽：是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根或芽。器官发生方式：1）先芽后根：先分化芽，芽形成后，在芽的基部长出根进而形成完整植株。2）先根后芽：先分化根，再在根上产生不定芽进而形成完整植株。3）在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。七愈伤组织：实质上是一团无序生长的细胞，这些细胞大多处于随机分裂的状态。（器官、组织培养时细胞分裂首先发生在伤口部位）

8、八体细胞胚或胚状体（定义）：离体培养下没有通过受精过程，但通过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体6/16 细胞依旧生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。界定：1）体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区不于无融合生殖胚。2）体细胞胚起源于非合子细胞，以区不于合子胚。3）体细胞通过了胚胎发育过程，以区不于离体培养中器官发生形成个体的途径。研究体细胞胚的模式植物：胡萝卜。九体细胞胚的形成途径：（简答）1.体细胞胚从外植体上直接发生：诱导时期;胚胎发育时期 2.间接发生：A.通过愈伤组织的体细胞胚的形成：诱导愈伤组织 的 形 成 诱 导 愈 伤 组 织 胚 性 化 体

9、细 胞 胚 的 形 成 2，4-D(浓度高)2，4-D(浓度低)2，4-D(浓度更低)B.通过悬浮细胞的体细胞胚的形成：诱导愈伤组织的形成诱导愈伤组织胚性化悬浮培养的胚性细胞团体细胞胚的形成。十植株再生的两种方式：器官发生，体细胞胚发生。第三章 体细胞遗传变异 一体细胞无性系：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体7/16 细胞无性系。体细胞无性系变异：由体细胞无性系表现出来的变异。从对生物遗传的阻碍而言，细胞工程技术本身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。二离体培养中的遗传与变异特点：遗传稳定性；变异的普遍性；变异的局限性；嵌合性 三非遗传变异 四 体细胞无性系变异的诱导与选择：（愈伤组织

10、再生植株（变异）诱变起始材料的选择原则：目标性状的可行性；试验植物的细胞培养技术水平；适当的细胞类型 七设计实验：培养抗纹枯病的水稻 突变体的选择：（1）直接选择 外 遗 传生理适应性基 因 表（生长素自养8/16 （2）间接选择：第四章 植物组织细胞培养 一 植物脱毒：利用植物组织培养技术脱出植物细胞中侵染的病毒，生产健康的生殖材料。二脱毒 差不多原理：病毒在植物体内的分布具有不均匀性。三脱毒苗制备流程：索取材料的病毒检测 外植体的选择及预处理 茎尖分生组织培养再生植株 9/16 脱毒效果检测 脱毒苗的保存与生殖 四（填空、简答）培养物的增殖方式：1.腋芽增殖 2.不定芽增殖3.体细胞胚增殖

11、 4.愈伤组织增殖 五花药培养（定义）：把发育到一定时期的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。从培养类型来讲，花药培养仍然属于器官培养的范畴。花粉培养（定义）：又叫小孢子培养，是从花药中分离除花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而发育成完整植株的过程。花粉培养属于细胞培养的范畴。花粉培养取材时期：四分体 小孢子时期；花药培养取材时期：单核晚期，双核早期。六花药培养的差不多程序：外植体选择外植体预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养。七花粉分离方法：（1）机械分离法：将花药置于盛有少量液体培养基或与培养基等渗的蔗糖溶液的培养皿中，用平头的玻璃棒或

12、注射器内管轻轻挤压花药，使其散出花粉。（2）花药漂移培养自然释放法：将通过一定时刻低温处理的花药，10/16 接种于液体培养基中，培养数天后，花药开裂，释放出花粉粒。（3）磁拌法:将花药接种于含有液体培养基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力搅拌器上，低速转至花药呈透明状。八依照在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括：胚培养，胚乳培养，胚珠培养，子房培养。九幼胚培养的关键技术：取材时期：多为球形胚至鱼雷形胚时期。十幼胚离体培养的常见的生长发育方式：胚性发育，早熟萌发，愈伤组织。十一悬浮培养：是细胞培养的差不多方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。应用：1

13、.愈伤组织诱导：要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。诱导愈伤组织选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。诱导愈伤组织选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。2.悬浮系的建立与继代培养：一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件（简答）：11/16 A 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30-50 个细胞以下，在实际培养 中专门少会有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮体系。B 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮体系外观为大小均一的小颗粒，培养基清亮透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白色或淡黄色。C 细胞生长

14、迅速，悬浮细胞的生长量一般 2-3 天甚至更短时刻便可增加一倍。3.悬浮细胞的生长动态：P89 图 5-6（填空五个时期）延滞期，对数生长期，直线生长期，减慢期，静止期。（在减慢期进行继代培养）4.悬浮培养细胞的同步化：细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。（填空）同步化的方法：分选法；饥饿法；抑制剂法；低温法 P91 十二。单细胞培养方法：1、平板培养 2、看护培养 3、微室培养 4、双层滤纸植板培养 5、悬浮培养(简答)P86 十三。培养条件下的植物细胞次生产物积存特性：1.生长偶联型：产物合成与细胞生长成正比。如长春花碱、烟碱的合成 2.中间型：12/1

15、6 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。如蒽醌类物质合成的植物细胞 3.非生长偶联型：产物合成在细胞生长停止以后。如 紫草宁的合成。第五章 原生质体培养及杂交 一原生质体（protoplast）：除去细胞壁的裸露细胞。二原生质体的纯化方法：（填空）1、沉降法：甘露醇作渗透压调节剂，低速离心，原生质体沉降于管底。2、漂移法：蔗糖作渗透压调节剂，离心，原生质体漂移于溶液表面。3、梯度离心法：利用比重不同的溶液，离心，原生质体处在两液相的界面之间。三原生质体培养方法：（P118）1。液体浅层培养 2。固体平板培养 3。固液双层培养 4.琼脂糖珠培养（摇床震荡）5.悬

16、滴培养法：在培养皿盖上滴悬浮液，皿底加入培养液，皿盖翻过来盖于皿底上，封口培养。6.微滴培养法：悬浮液滴于皿底，封口培养。7.饲养层培养法：又称看护培养。先制备饲养层，再在其上培养有活力的原生质体。四原生质体活力测定方法：（P114）13/16 1.形态识不法 2.荧光素双醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生质体产生绿色荧光。3.酚藏花红染色法：有活力的原生质体不能被染色。4、荧光增白剂染色法：有活力的原生质体随着细胞壁的再生产生绿色荧光。5、伊凡蓝染色法：有活力的原生质体不能被染色。五 植物体细胞杂交：又称为原生质体融合，是指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行

17、离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞杂交的类型：1）体细胞杂交 2）体细胞-配子杂交 3）配子间细胞杂交 4）微细胞杂交 原生质体融合的种类（完整程度）：1）对称融合 2）非对称融合 六原生质体的融合方法之一:PEG 诱导融合法 1）特点：优点是成本低；融合子产生的异核率高；不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG 对细胞有毒害。2）作用机理：PEG 分子具有轻微的负极性，可与带正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成 H 键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；PEG 还鞥增加类脂膜的流淌性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。七原生质体的融合方法之

18、二：电融合的差不多过程 细胞膜的接触：原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，使原14/16 生质体紧密接触排列成串。膜的击穿：给予高频直流脉冲就能够使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。优点：1）不存在对细胞的毒害问题 2）融合效率高 3）融合技术操作简便 八（填空）原生质体的融合产物：异核体（核未融合）、同核体（同一亲本融合 AA）、未发生融合的双亲原生质体。九 杂种细胞的选择系统与体细胞杂种植株的鉴定（P131-132）（实验设计题）例：材料 月季（红）玫瑰（白）培养月季式玫瑰 分离原生质体：纯化、活力测定 融合方法杂种选择 膜的融合-细胞质融合（发生膜融合后的数小时）-核

19、融合（可能发生在细胞间期，也可能发生在第一次同步分裂过程中）。第六章 人工种子及种质贮藏 一人工种子（artificial seeds）：任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的生殖体。依照包被的程度可将人工种子分为三大类：裸露的或休眠的生殖体、人工种皮包被的生殖体、水凝胶包埋再包被的生殖体。二生殖体的种类及其培养技术：体细胞胚、微型变态器官、微芽。15/16 三人工种子由以下三部分组成：生殖体，人工胚乳，人工种皮。四包埋介质的要求：1、要能对生殖体起爱护作用，要对生殖体没有毒害。2、要求具有一定的缓冲强度，以保证生殖体在生产、运输和种植操作中的安全。3、能够提供类似于胚乳的营养

20、物质以供生殖体发芽的需要。4、应含有适当的杀菌剂。五理想的人工种皮：1 具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失；2 具有良好的透气性，以保证生殖体维持生理活性的需要；3 有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作；4 无毒无害，能保证生殖体顺利穿透发芽。第七章动物细胞培养 一离体培养的动物细胞可分为：贴壁依靠型，非贴壁依靠型，兼性贴壁细胞。二原代培养：将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖 10 代左右，如此的细胞称为原代细胞。三传代培养：从原代培养的细胞接着转结培养称为传代培养。四细胞系：由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群称作细胞系

21、 五培养细胞的保存 1、冻存 2、复苏。（慢冻快融）。16/16 第八章干细胞 干细胞：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。第九章克隆技术与转基因动物 一细胞核移植定义：利用显微操作技术将一种动物的细胞核转入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术。细胞核移植所得的杂种称为核质杂种。依照移植对象的不同分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。二克隆技术的应用：1、检验动物细胞的全能性；2、制备转基因克隆动物，进行生物药物生产 3、培育优良畜种，扩大良种种群；4、开展异种动物克隆，挽救濒危动物；5、与干细胞技术结合，开展治疗性克隆；6、利用核移植技术，研究生物学的差不多问题。三转基因动物：指在基因组内稳定的整合以实验方法导入外源基因，同时外源基因能够稳定遗传给后代的遗传工程动物。四转基因动物的制备过程：1、目的基因的分离与克隆；2、表达载体的构建；3、受体细胞的获得；4、基因导入；5、受体动物的选择及转基因 胚胎的移植；6、转基因整合表达的检测；7、转基因动物的性能观测及转基因表达产物的分离与纯化；8、转基因动物的遗传性能研究以及性能选育；9、组建转基因动物新类群。