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1、.CCK8 检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项 一、CCK8 检测细胞增殖/毒性的原理 Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有 WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。用
2、途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 CCK8 的优点：使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；CCK-8 法能快速检测；CCK-8 法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；CCK-8 法的重复性优于 MTT 法；CCK-8 法对细胞毒性小；CCK-8 细胞活性检测试剂中为 1 瓶溶液，毋需预制，即开即用。CCK8 的缺点：与 MTT 法相 比，CCK8 和 XTT 的价格比较贵。CCK8 试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：检测方法 MTT 法 XTT 法 WST-1 法 CCK
3、8 法 甲臢产物的水差（需加有机好 好 好.溶性 溶剂溶解）产品性状 粉末 2 瓶溶液 溶液 1 瓶溶液 使用方法 配成溶液后使用 现配现用 即开即用 即开即用 检测灵敏度 高 很高 很高 高 检测时间 较长 较短 较短 最短 检测波长 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm 细胞毒性 高，细胞形态完全消失 很低，细胞形态不变 很低，细胞形态不变 很低，细胞形态不变 试剂稳定性 一般 较差 一般 很好 批量样品检测 可以 非常适合 非常适合 非常适合 便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷 二、CCK8 检测细胞增殖/毒性的方法 实验一：细胞增殖分析 1、
4、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到 96 孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约 100ul 细胞悬液，同样的样本可做 3 个重复。3、37培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。4、加入 10ul CCK8：由于每孔加入 CCK8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10%CCK8 的培养基，以换液的形式加入。5、培养 1-4 小时:细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要
5、较长的显色时间（5-6 小时）。6、测定 450nm 吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长 600-650nm。实验二：细胞毒性分析 1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到 96 孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约 100ul 细胞悬液，同样的样本可做 3 个重复。3、37培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。.4、加入不同浓度的毒性物质 5、37培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。6、加入 10ul CCK8：由于每孔加入 CC
6、K8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。7、培养 1-4 小时:细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6 小时）。8、测定 450nm 吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长 600-650nm。注：若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 L 0.1M 的 HCL 溶液或者 1%w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。如
7、果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。三、CCK8 检测细胞增殖/毒性的注意事项 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔(100 l 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔(100 l 培养基)。酚红和血清对 CCK8 法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。CCK8 可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在
8、细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。CCK-8 在 0-5下能够保存至少 6 个月，在-20下避光可以保存1 年。.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。在培养基中加入 CCK8，培养一定的时间，测定 450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入 CCK8，培养一定的时间，测定 450 nm 的吸光度作为空白对照。金属对 CCK-8 显色有影响：当终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100%抑制。悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。