《CCK8检测细胞增殖毒性的原理及注意事项.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CCK8检测细胞增殖毒性的原理及注意事项.doc（7页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。用途：药物筛选、细
2、胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点： 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； CCK-8法能快速检测； CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； CCK-8法的重复性优于MTT 法； CCK-8法对细胞毒性小； CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。CCK8的缺点： 与MTT法相 比，CCK8和XTT的价格比较贵。 CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水溶性差（需加有机溶剂溶解）好好好
3、产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm细胞毒性高，细胞形态完全消失很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。3、37培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要
4、培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。实验二：细胞毒性分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板
5、中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。3、37培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。4、加入不同浓度的毒性物质5、37培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。7、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Form
6、azan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。注： 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 L 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项 当
7、使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 l 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 l 培养基)。 酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。 CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。 CCK-8在0-5下能够保存至少6个月，在-20下避光可以保存1年。 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 在培养基中加入C
8、CK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。 金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。7 增间时延毒量细增，理较比于法制%0，事事话 是果级敏使色的、 %会硫化铅化 为终响色- 照对作吸 0测间一， 加基的入可的虑还验加在照空光 定时一， 加基用定作基加孔一最况
9、差误准积，燥易孔外养时养年存以避 在 存能在果响免染免需过定验实细细母不，大以去而吸本白除以扰造测法 )基 00/ 0于量荐因对度灵白。养 00孔 ,为种小细贴孔准注/增检 理的/增测 三可 收空 后加养扣 直培更可 况-较影药简当药掉 养的后，细 洗培基 培 （鲜更 在 的原性/质化生不.吸测时 下室光.板遮并 / 或/ 0 入中以， ： - 0 比，0-长检测 长波-建： 试）小 （于色简要， 的形胞胞别。佳和以，继分话够。果如不本 为 同类:小中-含 匀帮板 敲后 完议差来名壁在试-可较 - 孔氧由： 入硝、基间上一)，来周-根要，胞细基的性基，时质 性加养养,物 物浓入磺去以可贴-需，
10、时养四培壁单后细养】箱它复个可的，体胞 0甲约数铺-合 ：孔 计吩细悬备硫 分毒甲。（ 0波 ， 测检 进双采建 ）作小 时的细要胞少 脱 形细还别件最具认养继度话不果如的也量色 成，物种: 小养培形换以的 %优验敏肿定胞定增胞筛药分毒胞进直特可。成的胞量瓒的） 含点直或混板击轻剂在，误而在试能有比 加每 入 去以，要果时小 约贴后细中养复个做样，悬 0每数铺适根孔到种计细悬备 分增法的毒胞检 便便便一程适适适可检品很一较一定不胞不态不胞消完形毒 0 波最较较较时很很敏即即现使使方溶溶溶粉性解溶有溶水 - 方：剂性殖的加或漏产意，接颜培与红色颜 贵较的 相法点的用即即需，瓶剂性细小性细-法 于优的-度胞低测甚，度的 测速快-剂机素性要不细去，