《高效液相色谱讲座(1-6)_中科院大连化物所.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱讲座(1-6)_中科院大连化物所.pdf（60页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、讲座高 效 液 相 色 谱 讲 座*第一讲高效液相色谱概貌和设备王 俊 德（中 国科学院大连化学物理研究 所）1 液相色谱的发展简史色谱是这样一个过程，即混合物中各组分在称之为固定相和流动相的两相之间具有不同的分配系数，因而当此混合物从固定相的一端加入并随流动相向前移动的过程中，各组分在固定相上有不同的保留而被分离。历史上第一 次提出“色谱”(C h r o m a t o g r a-p h y)这个名词，并用来描述这种实验的人是俄国 植物化 学家茨维 特（T s w e t t，他在1 9 0 6年发表的关于色谱的论文中写到：一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入
2、，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样。茨维特把这些色带称为“色谱图”(C h r o m a t o g-r a m)，相应的方法叫做“色谱法”(C h r o m a-t o g r a p h i c m e t h o d)。这就是最初的液相色谱。后来约2 0 年间这一技术并未得到人们的重视。三十年代以后，纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱相继出现。特别是1 9 5 2 年英国学者马丁（Ma r t i n）和辛格（S y n g e）基于他们在四十年代在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技
3、术向前推进了一大步。气相色谱在此后的十多年间发展十分迅速。1 9 5 8年基于Mo o r e和S t e i n的工作，离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但分离效率尚不理想。六十年代中后期，由于把从气相色谱得到的广泛的理论和实践上的经验应用于液相色谱系统的设计，以及在机械、光学和电子等技术上的进步，沉睡多年的液相色谱技术开始苏醒。出现了包括高效分离柱、高压输液泵和高灵敏度检测器的近代高效液相色谱装置和仪器。在柱效、速度和灵敏度方面远远超过经典液相色谱。七 十年代中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。由于高效液相
4、色谱的实际分离时间可以是比较短的，但操作条件的选择和定性定量分析是件费时、费力、麻烦的工作，因而下一个目标将是发展能解决这类问 题的具有某些人工智能的色谱仪器。目 前高效液相色谱已成为化学、化工、生化、医学和环保等学科领域中重要的分离分析技术，是分析化学家手中用以解决他们面临的各种实际分析课题必不可缺少的工具。分析仪器国际市场的最近调查表明，液相色谱（包括高效液相色谱，柱色谱，氨基酸分析和离子交换色谱）是分析仪器中最大的市场。预计在1 9 8 4 年继续以年平均增长率2 0 的速度发展。其中高效液相色谱则是增长最快的，达2 6。2 高效液相色谱的特点与其他色谱方法的比较高效液相色谱(H i g
5、 h P e r f o r m a n c e*本讲座的内容曾 在1 9 8 1 年大连市科协和辽阳 石油化纤总公司主办的两个色谱学习 班上讲授过。在这两次学习班上，担任液相色 谱部分讲课的有卢佩章、于衍卿、林丛 敬、王俊德、张玉奎、商振华、姚 荣余等。本文发表前，曾在卢佩章先生的统一指导下，由 有关同志 做了 若干重要的修改和补充，并将陆 续与 读者见面。L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y，简称H P L C）又称高压、高速、高分离度、近代液相或近代液相柱色谱，但推荐使用第一个术语，是高效液相色谱，尽管有人时而也称为高性能液相色谱。通过以下同经典
6、液相色谱和气相色谱相比较，我们可以看出高效液相色谱具有分离效能高，分析速度快，检测灵敏度高和应用范围广泛的特点，特别是适合于高沸点大分子，强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。1）现代高效液相色谱与经典液相色谱的比较经典液相色谱使用 的柱填料通常是1 0 0 微米的粗粒度全孔吸附剂（硅胶或氧化铝等），固定相传质扩散缓慢，因而柱效率很低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离；而高效液相色谱采用51 0 微米微粒填料，传质快，柱效可比前者高2 3 个数量级，2 5 厘米长的硅胶柱柱效可达2 万理论塔板，可以分离上百个组分，有更高的峰容量（即一定时间内色谱图上所能容纳的色谱峰数目）。经典液相色谱中，
7、填料通常是装在1 2 米长，1 2 厘米粗的玻璃管中，使用一次便丢掉，每次分离都要重新装柱，这就造成了人力物力上的浪费，而高效液相色谱使用尺寸小得多的封闭式可重复使用的色 谱柱，能在同一根柱上进行数百次 的进 样操作。由于微粒填料传质扩散快，又使用了高压输液泵，因而快速分析有可能实现。例如在2毫米，内径5 微米硅胶柱上用己烷冲洗，在3 0 0 公斤 厘米2 压力下1 0 秒钟分离了包括四氯乙 烯在内的从苯到对三联苯七个芳烃的混合物。近代高效液相色谱实现高精度连续操作仪器化，使定性定量分析的准确度比经典液相色谱大为改善，特别是微处理机的使用更提高了分析精度（定量准确度可达1）。和另一类板状液相色
8、谱薄层 色谱T L C）相比较，高效液相色谱也同样具有上述优点。近年来发展的高效薄层色谱（HP-T L C）部分地克服了T L C固有的缺点，可以和高效柱液相色谱互为补充。2）高效液相色谱与气相色谱的比较气相色谱自五十年代出现以来，获得了飞速发展，它的特点是高效、快速和灵敏，其分离分析复杂混合物的能力是以前其他色谱方法无法比拟的，应用相当广泛和普遍。但是由于气相色谱使用气体流动相，被分析样品必须要有一定的蒸汽压，汽化后才能在柱上分析，这使分离对象的范围受到一定的限制。对于那些挥发性差的物质（高沸点化合物），汽化温度和柱温必须很高，这不仅给设备和仪器制造带来了 不少困难，更重要的是许多高分子化合
9、物和热不稳定的化合物在汽化过程中分解，因而改变了原有的结构和性质。尤其是一些生化样品等具有生物活性的物质，温度过高会变性失活。这样的样品分析用气相色谱就难以胜任了。此外对于一些极性化合物，如有机酸、有机碱等，气相色谱也遇到麻烦。虽然有的可通过衍生化法解决，有的则无能为力。据估计现在已知的化合物中，仅有2 0 的样品可不经过预先的化学处理而能满意地用气相色谱分离。与此相反，液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，液相色谱一般在室温下操作，最高不超过流动相溶剂的沸点，所以只要被分析物质在流动相溶剂（各式各样）中有一定的溶解度，便可以分析。所以液相色谱特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合
10、物，例如生化物质和药物，离子型化合物，热不稳定的天然产物等等。事实上，在已知的化合物中大约有7 0 是不挥发的，主要出现在生命科学，环境科学，高分子和无机化合物中，在这方面高效液相色谱有着广阔的应用潜力。液相色谱中由于流动相也影响分离过程，这就对分离的控制和改善提供了额外的因素。气相色谱中的载气一般不影响分配，所以在气相色谱中要靠改变固定相来改变选择性，而在液相色谱中除了改变固定相外，还可以改变冲洗剂达到同一目的。所以液相色谱中的固定相不象气相色谱那 样种类繁多，仅仅几种固定相就可以解决相当范围的问题。和气相色谱相比，高效液相色谱对样品的回收比较容易，而且是定量的，这对任何规模的制备目的特别有
11、利。此外在高效液相色谱中必须特别注意“柱外效应”对柱效率，因而也对色谱分离能力的影响。这是因为物质分子在液相中的扩散系数比在气相 中小4 5个数量级，流速也慢2 3 个数量 级，因此在从进样到检测之间，在除柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低，这就给仪器制造方面提出了一个新的问题。当然随着柱型的发展（如柱子变细、变短）和填料的改进（如粒度变小或更加均匀），在柱内发生的色谱分离过程中的谱带宽度越来越狭窄，因而柱外效应的影响也越来越不容忽视。最后需要说明，目前高效液相色谱检测器的灵敏度尚
12、不及气相色谱，这是需要也已经引起广大色谱工作者注意研究的课题。应当指出，高效液相色谱是适应科学技术的发展而发展出来的，它和气相色谱各有所长，相互补充。在高效液相色谱越来越广泛地获得应用的同时，而气相色谱仍然发挥着它的重要作用。3 高效液相 色谱流程和设备图1-1 表示了一台高效液相色谱仪的方框图。高压泵（2）将溶剂经进样器（4）输入色谱柱（5），样品从进样器引入，分离情况用检测器（6）监视，数据系统（8）记录，流出组分可在馏分收集器（9）中收集，如果要做梯度操作，可使用溶剂或流速梯度程序控制器（3操纵泵的动作，有时要控制色谱柱和检测器的温度，需配温度控制器（7整个仪器的各个部件又可用微处理机（
13、1 0控制，结果在显示打印器（1 1上报告出来。由此可见，高效液相色谱设备中的基本部件是输液泵、色谱柱和检测器。但为了能得心应手地工作，仪器应当适应多功能的要求，同时配有梯度装置、馏分收集、柱和检测器恒温系统，数据处理系统以及微处理机控制系统等部件。这里需要特别指出的 是，关于色谱仪的几个主要部件的性能问题，生产厂家一般都能给予足够的重视，但往往容易忽略“柱外效应”的影响。过大的柱外死体积会明显的损失柱效，从而导致总的分离能力下降，特别是当柱径减小到2 毫米或更小时。下面将简要介绍一下高效液相色谱设备中各部件的基本特点，以了解其概貌。至于各部分的细节将是以后各讲讨论的主要内容。输液泵泵是一套高
14、效液相色谱设备中重要的 单元部件，是驱动溶剂和样品通过色谱分离柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。用于分析目的的 泵应当流量稳定（1)，耐高压（3 0 0 6 0 0 公斤 厘米2，能耐各种流动相，如有机溶剂、水和缓冲液。目前，商品高效液相色谱仪普遍采用泵体积小，方便多用的往复泵和隔膜泵。以往复泵为例，又有单、双和三泵头结构之分，显然，在单泵头的 情况下，如果没有必要的补偿机构，脉动较大；若改为双泵头，或更进一步，三泵头，交替动作的柱塞分别以1 8 0 和1 2 0 的相位差排液和吸液，则输出液流的脉动大为改善。因而后两种往复泵更受欢迎。对于极性范围宽或分子体积
15、相差较大的复杂混合物，为了能在较短的时间内对所有各组分均实现满意的分离，常采用梯度淋洗操作。这时需要使用两台泵，按一定的程序逐步增加混合溶剂中的极性成分，以提高单位时间内的峰容量。用于刚性微粒柱装柱的高压泵多是气动泵和往复泵，主要恒量指标是能 产生 高压4 0 0 1 0 0 0 公斤 厘米2）和较大的 排液量（十至数十毫升 分）。这是自 行装柱的实验室所必需的设备。色谱柱人们常说色谱柱是一台色谱仪的心脏，因为色谱的核心问题分离，是在这里进行的。在色谱发展史上，色谱柱填料与柱技术的发展一直是色谱工作者共同关心的问 题，可以 说，液相色谱的每一个重大发展都是和这一关键的一次突破密切相关。为适应不
16、同的分离分析要求，可有不同的柱型，内装不同性质的填料。最常使用的色谱柱是1 0 2 5 厘米长、2 5 毫米内径的内壁抛光的不锈钢管柱，内装5 1 0 微米高效微粒固定相。采用高压匀浆装柱技术填充。相同柱长的效率远远高于气相色谱，以2 毫米细内径柱为例，2 5 0 厘米长的5 微米 YWG硅胶柱柱效可达2 0 0 0 0 理 论塔板，而5微米Y Q G-C H反相键合相柱达 1 4,0 0 0理论塔板。因为高效柱的填充需要特殊的设备和技术，所以国际上各色谱仪和色谱材料厂家均提 供预装柱（P r e-p a c k e d c o l u m n。进样器 待分析样品从柱头的 进样器引入，可分注射
17、器进样、停流进样、阀进样和自动进样器进样四种方式。注射器和阀进样为最常用。1 0 0 公 斤 厘米2 以下的 进口压力时可用1 1 0 微升的微量注射器进样，在这种情况下一般能获得最高的柱效率，但进样重复性不佳，特别是在较高压力下。阀进样是比较理想的，进样体积 可变，也可以固定，但一般说来，柱效受些影响。自 动进样器适合于多样品重复操作，便于用微处理机控制，实现自动化。检测器被分析组分在柱流出液中浓度的变化可通过检测器转化为光学的或电学的信号而被检出，是色谱仪的“眼睛”。检测器性能的好坏直接关系着定性定量分析结果的可靠性和准确性。在高效液相色谱中最常用的检测器是光学检测器，例如示差折光、紫外吸
18、收或分光光度检测器。前者是通用型的检测器，但灵敏度较低，适合 于常 量分析；后者中，紫外吸收有比较高的灵敏度，但只能检出在仪器特定波长下有吸收的化合物。紫外可见分光光度检测器可适用较宽的范围，可以弥补单波长吸收检测器选择性太强的缺陷，因而是一种应用面 较广 的高效液相色谱检测器。近年来发展的二极管阵列紫外检测器允许对柱流出物进行不停流的瞬间的波长快速扫描，通过微处理机控制，获得光吸收、波长和时间的三维 色谱 光谱图，从而取得更多的定性和色谱峰纯度鉴定的信息，是一种比较理想的检测器。萤光检测器有较高的灵敏度，一般说来可比紫外吸收高1 0 1 0 0 0 倍，但也有更专一的选择性。对于一些电活性物
19、质（如无 机离 子，有机酸、碱和两性离子），电化学检测器是一类较好的选择性检测器，例如对有机胺，安培型电化学检测器的灵敏度可比紫外吸收高2 3个数量级。但总的说来，高效液相色谱的检测器目前尚不理想，灵敏度不及气相色谱。发展通用灵敏和更专一的检测器是今后应探索的一个重要课题。恒温控制不象气相色谱仪那样 每台必配，许多场合下色谱柱和检测器在环境温度下使用即能满足要求。必要时在较高温度下恒温操作，或者是为了增加柱效，改善分离，或者是为了取得更准确的热力学数据。大部分检测器也不一定精确恒温。受温度影响大的是示差折光检测器，因为折光指数随温度变化很大，温度不恒定，噪音和灵敏度显著受损。恒温下的紫外检测器
20、也有利于增加稳定性。馏分收集器如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做其他波谱鉴定，或获取少量试验样品的小型制备，馏分收集是必要的。用小试管收集，手工操作只适合于少数几个馏分，手续麻烦，易出差错。馏分收集器比较理想，因为便于用微处理机控制，按预先规定好的程序，或按时间，或按色谱峰的起落信号逐一收集和重复多次收集。数据获取和处理系统把检测器的信号显示出来的数据系统可以有多种形式。最简单的是电位差式长图记录器，记录信号随时间的变化，而得到色谱流出曲线或色谱图。而对定性定量较有利的是采用积分仪，记录保留时间或峰号，以 及峰面积。先进的高效液相色谱仪多用微处理机控制，这通常是一台专用的微
21、计算机，其功能有二，一是作为数据处理机，例如输入定量校正因子，按预先选定的定量方法（归一化、内标法和外标法等），将面积积分数换算成实际的成分分析结果，或者给出某些色谱参数；二是作为控制机，控制整个仪器的运转，例如按预先编好的程序控制冲洗剂的选择，梯度淋洗、流速、柱温、检测波长、进样和数据处理。所有指令和数据通过键盘输入，结果在阴极射线管或绘图打印机上显示出来。更新一代的色谱仪，应当具有某些人工智能 的特点，即能根据已有的规律自动选择操作条件，根据规律和已 知的数据、信息，进行判断，给出定性定量结果。学术活动简讯第三次全国裂解气相色谱学术交流会在郑州召开第三次全国裂解气相色谱学术交流会于3 月1
22、 9日 至2 3 日 在郑州召开。来自全国各地区的5 4 个 单位，共6 6 名代表出 席了会议。中国化学会 派员参加会议；河南省化学会理事长刘敬琨研 究 员 致 了贺词；会议还收到了著名高分子化学家中国科学院学部委员钱人元教授和著名高分子化学家复旦大学材料科学研究所所长于同隐教授发来的贺信。裂解气相色谱具有方法灵 敏、快速、准确，仪器结构简单等 特点，现已 在合 成橡胶、塑料纤维、生 物生化、临 床医学、法医和地质等有关领域中都得到广泛的应用。会议共收到学术论文4 6 篇，内容涉及面广，会上还组织了三次专业座谈会，与会代表进行了热烈的讨论。整个会议自 始至终学术气氛十分活跃。这次会议必将进一
23、步推动我国 裂解气相色谱技术研究和应用的发展。（周秋菊）河南省首届色谱学术交流会在郑州举行由河南省化学会分析专业委员会和省科委 大型仪器管理办公室联合组织召 开的河南省首届色谱学术交流会，于1 9 8 4 年 4 月 4 日 至 7 日在郑州大学举行。省化学会分析专业委员会主任田锡超高级工程师主 持了会议，分析专业委员会副主 任刘少 陵副 教授致开幕词，省化学会副理事长王文 祥教 授讲了话。会 上宣读了中 国化学会色谱专 业组给大会的贺信。会议回顾和检阅了 河南省近年来的色谱工作。会前编印了 河南省首 届色谱学术交流会 文集，属应用方面的文章占 8 6，理论方 面的文 章 占1 4。文集显示出
24、色谱技术已 经应用到了石油、化工、环境保护、医药卫生、轻工、机械、农业、食品等方面，并取得了较好的成绩。来自 全省高等学校、科研、厂矿、企业等8 3 个单 位的共 1 0 4 名代表 齐集一堂，进行了色谱技术和理论方面的学术交流。在这次会议上还正式建立了河南省色谱学组，制 定了今后两年的技术培训和学术交流等活动计划。王文祥教授在讲话中指出，这次会议的召 开，是党的三中全会以来 我省化学界蓬勃发展的极好见证，是 我省化学界的一件大喜事。与会代表决心作出更大努力，使色谱技术更好地为四化 建设服务。（刘玉华）讲座高效液相色谱讲座高效液相色谱的基本参数和基础理论（上）张玉奎李秀珍卢 佩章（中 国科学院
25、 大连化学物理研究所）色谱分离是基于样品组分在两个非互溶相间的多次反复平衡分配，利用分配中的微小差异而达到分离的目的。两个非互溶相分别称为流动相和固定相。为了描述分配过程和评价色谱柱性能，从而找出最佳 分离条件，需要有一系列的色谱参数。2-1 保留值保留值是用来描述样品组分在色谱柱中保留程度的参数并作为色谱定性的指标。其表示方法有保留时间、保留体积、调整保留时间和调整保留体积。1 保留时间和保留体积一般认为当进样量很小时，样品从柱中流出呈高斯曲线分布。从进样开始到峰极大值所需时间 称为保留时 间，以 t R 表 示，如图2-1 所示由于流出时间与流动相流速成反比，因此又可用保留体积作为保留值参
26、数，以V R 表示：式中t R保留时间（分），流动相流 速（毫升 分）。某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出所需流动相体积，一般情况下常以毫升为单位。对细内径柱和毛细管柱，由于所需流动相流量很小，F的单位用微升 分，此时V R 可采用微升为单位。不保留物质流出时间以 t表示，如图2-1 所示。而t F即为不保留物质死体积，简称死体积。死体积不仅与柱结构有关，而且与进样系统、检测系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时，t F才表示柱内流动相所占的体积，以V 表示。任何色谱过程的基本保留方程式为：V R Vm KV(2-2)其中K 平衡分配系数，V固定相体积，V流动相所占体积（当 柱外体积不容
27、忽略时，V 表示柱内空隙及柱外体积之总和）。由式（2-2可知，溶质的色谱保留 行为主要是由该溶质在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决定的，而K是溶质在两相间达到平衡分配性质的度量，其定义为溶质在两相间达到瞬间平衡时在固定相和流动相中之浓度比，即其中n,n分别为得质在固足相和流鞫 动 相嘀 中的量。2 调整保理时间和调整保留体积扣除不保留时间和不保留体积的保留值定义为调整保留时间（t R）和调整保留体积(VR)，如式（2-4）和（2-5）所示：t R t R-t(2-4)VR V R V m（2-5)保留值是色谱过程热力学的重要参数，当色谱操作条件一定时，不同物质有其特定的保留值，这 是色谱定
28、性分析的基本依据。在液相色谱中，由于流动相参予了溶质分配过程，因此样品组分的保留值不仅与固定相的性质有关，而且受流动相性质变化的影响很大，因此研究液相色谱中流动相组成对保留值的影响是分离条件最佳化的基础。8 容量因子（k）容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数，它是样品组分的量在两相中分配的比值，定义为：将式（2-6代入式（2-3得：式（2-7代入式（2-2得：将（2-8式两边除以冲洗剂流量Fc则得：整理后并结合（2-4式得：可见容量因子就是调整保留时间与死时间的比值，这可从色谱图上测得。在液相色谱中k只与固定相、流动相性质及柱温有关，而与流速和柱尺寸无关。4 死体 积（V m和 死时间（t
29、0）的测定在计算色谱参数中，常常用到t或V m值。而液相色谱中的t 0 值不如气相色谱那样容易测定。这是因为一方面液相色谱条件下不易找到一个在固定相上完全不保留的惰性物质，另一方面由于空间排斥作用，一些较大分子不能进入固定相微孔中，因而在t 0 前流出，不易判断。下面介绍几种常用的方法。1）采用比流动相溶剂分子少一个-C H 2基团的同系物测定法，例如当用已烷作冲洗剂时，测定戊烷的保留时 间作 为t 0 值；2）在用混合溶剂作流动相时，以在检测器上有显著信号的纯溶剂作为测试死时间的样品。如在用甲 醇 水作流动相时，用甲醇作测死时间的样品测其t 0 值；3）在硅胶色谱中，当 用紫外检测器时，采用
30、四氯乙 烯作惰性溶质，反相色谱中亦有采用苯甲 酸或硝酸等作惰性溶质，可近似地测定t 0 值。（4）计算法求t 0：计算法可根据下式求死时间其中d c色谱柱管平均内径；L 柱长；F c 流动相体积流速。当d c L院毫米为单位，F c 以毫升 分为单位时T 为柱总孔隙度，采用式(2-1 2)计算死时间，其准确性取决于柱内径的均匀性、柱填充程度及柱外死体积占总死体积的比例。由 式（2-1 2)亦可计算出色谱柱总孔隙度。2-2 选择性指标（和相 对保 留值（）选择性指标表示为相邻二峰保留时间的比值，定义为：相对保留值表示为相邻二峰调整保留时间的比值：和之间存在如下关系：由上下同除以k（）并整理后面将
31、会讨论到，采用做为选择性指标要比 值更为直观和有利。与值一样，值是与柱温、固定相种类、流动相组成有关的参数。2-3 冲洗剂线速度（u，柱总孔隙度（T）和渗透性（K f）1 冲洗 剂线速度（u）在色谱理论计算中，通常以流动相的平均线速度u（厘米 秒）来代替体积流速。线速度通常可由 死时间（t 0）和柱长（L）计算出：也可由 体积流速和色谱柱的横截面积（A）以及柱孔隙度（）计算u值：由式（2-1 7）可以看出线速度和柱长L 定时，死时间t 0 一定而与柱内径无关。2 柱总孔隙度柱总孔隙度是柱横截面上流动相占的分数。其大小主要取决于柱填料的类型。薄壳型填料色谱柱，流动相能占 据的横截面大约为空柱截面
32、的4 0%，因此其0.4。对于多孔硅胶或以硅胶为基质的填料，其值在0.8 5 左右。如前所述，柱总孔隙度可 由下式 计算出：式中各参数的单位参见式（2-1 1。V c 为空柱体积，3 渗透性（Kf）在液相色谱中，由于采用细 粒度填 料3-1 0 微米）和粘度远比 气体大的液体作流动相，所以 一般情况下柱压降较大，因而对操作和设备提出了更高的要求。渗透性的定义为：式中 K 为渗透性常数（厘米2），为流动相粘度（泊或达因 秒 厘米2），为柱压降（大气压1 0 6 或达因 厘米2，F为冲洗剂流速（毫升 秒），L 为柱长（厘米），d c 为柱内径（厘米）。由于渗透性与填料的颗粒大小 直接相关，因此又可
33、用下式近似地计算K f 值：其中d p 为固定相平均粒于直径（厘米）从式（2-2 0）和（2-2 1）可知，根据上述基本色谱参数又可估算填料的平均粒子直径：式中r 为柱管半径（即r d c/2，所得d p的单位为（厘米）2-4 柱效能指标众所周知，色谱中柱效率是用塔板数或塔板高度来描述的。1.塔板数和塔板高度理论塔板数的定义为：其中N 理论塔板数；t R 保留时间；色谱溜出曲线的标准偏差，即为峰高 0.6 0 7处的峰半宽度。为了方便起见，通常采用峰半高处的峰宽 t 1/代替 计算柱效。根据高斯方程，色谱流出曲线上任何一点的高度（h i）与峰最大值处（t R）的高度（h o）间的关系为：可导出
34、将式（2-2 4）入式（2-2 3）并整理得：这是目前使用最广泛的计算N的公式。此外还有用测量峰底宽（Wb）的办法计算N 值，由于Wb 4(2-2 6)代入式（2-2 6)则得其中Wb 是在色谱峰的拐点处做切线与基线相交，交点之间的距离 为 Wb。由于测量精度差，现已不常采用。理论塔板高度的定义为：考虑到样品穿过柱内空隙体积时，并不与固定相发生相互作用，可采用扣除死体积的调整保留时间t R来计算塔板数或塔板高度，称为“有效塔板数”或“有效塔 板高度”：H 有 效 L/N 有 效N 有 效和N 之间的关系为在高效液相色谱中，人们通常采用理论塔板数或理论塔板高度来描述色谱柱效率。因为可以 做到对不
35、同物质测得的数值基本为一常数。此时用作选择性指标，2 理论板高方程目 前已 有不少作者从理论上解释影响理论塔板高度的因素，即板高方程，但一般均较复杂，这里仅举几例说明。（1）Va n D e e mt e r 方程H A B/u C u(2-3 1)式中A为涡流扩散项，B为纵向扩散项（或称分子扩散项），C为传质扩散项，且有A2d pB2 Dm其中 为柱填充因子，其值在1-2 之间；d p为柱填料粒子直径；为弯曲因子，D m 为样品组分在流动相中的分子扩散系数。液相色谱中，传质速率是影响谱带宽度的重要因素。采用微粒固定相，使得传质速率加快，H值降低，即柱效高。根据 V a nDe e mt e
36、r 方程所获得的 Hu关系曲线如图2-2 所示，H u 关系曲线的最小值所对应的u 值为最佳线速度。（2 H o r v a t h 和L i n的液相色谱板高方程H H d i s p H e d i f f H i d if f H k in(2 3 2)其中Hd i s p 为溶质在间隙中轴向扩散对板高的增量；H e d i ff 是与粒子界面“膜”阻力有关的板高增量；H i d if f 为粒子内部扩散传质阻力对板高的贡献；Hk i n 为由于动力学阻力对溜出物的束缚所导致的板高增量。且有式中u e，D m 和d p 分别为间隙流动相线速度、溶质在流动相中的扩散系数和粒子直径。k 0
37、值由 i(1-e)/e 给定，i 和 e 分别为粒子内部和粒子间孔隙度。，和 是柱填充结构参数，是多孔粒子的弯曲因子，k是容量因子，k d 是脱附速率常数。3）简单的经验关系表达式大量试验证明在气相和液相色谱中，保留 值和峰半高宽度间存在如下的线性关系：2t 1/2 a b t R(2-3 3)2 V1 2 a b V R(2-3 4)其中2t 1/2 和2V 1/2 分别为以时间和体积为单位的峰高半宽度；t R，V R 分别为溶质的保留时间和保留体积；a,a ,b,b 为线性方程的常数。从上述线性方程可导出容量因子为k 的物质理论板高H以及k 为 1 和无穷大时的板高Hl 和H：其中方程 2
38、-3 5）要比（2-3 1）和（2-3 2）简单方便，同时包含了k 值对H的影响。如把k =1和分别代入方程（2-3 2）中，可得到H 1 和H 的方程：其中H e x t 是柱外效应对塔板高度的贡献，当k较小时，这一影响特别显著。3 桂外效应对柱效率的影响由于样品分子在液相中的扩散系数很低，而液相色谱用冲洗剂流量又很小，因此柱外体积包括进样系统和检测系统的死体积对色谱峰的谱带展宽影响很大，使得柱效明显下降，这在使用细内径高效柱时尤为突出。实验证明，当采用相同柱长和线速度，不同内径的一系列色谱柱时，k 不同的溶质其保留体积和半宽体积之间存在一近似的线性关系：2V/2 a b V R(2-3 6
39、)当减小柱后连接管和流动池体积时，直线截距 a 值相应下降，而b 值几乎不变，如图（2-3所示。可以看出柱后体积不同时理论塔板高度也不同。很明显，柱外效应对k小的物质，特别是当使用内径为2 毫米细内径柱时，影响很大。因此，如何使色谱柱系统柱外效应减至最小，是发展细内径高效柱的技术关键。实验证明，对2 毫米细内径柱，当柱外体积为1 1 微升时，随着k值的增加，塔板高度逐渐下降，而当柱外体积减小至2 微升时，H值不再随k 值而变，对所有组分几乎为一常数。柱外效应不仅影响柱效，而且对峰不对称度也有明显的影响。图2-4 给出了不同 物质在2-6 毫米内径柱上其不对称度与保留体积间的关系曲线。可以看出，
40、柱后死体积为2 微升时（B 线），保留体积小的物质（即k值小的物质），其峰不对称度要比柱后体积为1 1 微升时好得多。这里峰不对称度的计算方法如下：由峰顶至基线做垂线，测定峰高为1/1 0 处的垂线两测之峰宽，后面与前面之比值即为峰不对称度。（上 接6 2 页，C o n t i n u e d f r o m p a g e 6 2）A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e sT h e a m i n o a c i d a n a l y s i s a s a s p e c i a l c h r o m a-t
41、o g r a p h i c t e c h n o l o g y h a s b e e n e x t e n s i v e ly a p p l ie di n a g r i c u l t u r e.o m e h i e f p p l i c a t i o n s r e e s c-r i b e d i n t h i s a r t i c l e,u c h s h e h a r a c t e r f i g ha mi n o a c i d c o n t e n t s i n s o m e s o r t s o f wh e a t c a nb
42、 e i n h e r i t e d t h r o u g h t h e i r p r o g e n i e s;h e u l t i v-a t e d m e s a u r e s,s p e c i a l l y p p l y i n g e r t i l i z e r s a nr e ma r k a b l y i n c r e a s e t h e a m i n o a c i d c o n t e n t s i nt h e g r a i n o f r i c e;n d h e o l l e n f a i z e s na b u n
43、 d a n c e i n t h e m a j o r k i n d s o f a m i n o a c i d s,e s p e c i a l l y l y s i n e w h i c h i s n e c e s s a r y f o r h u m a nb o d y,n d h u s t i l l o s s i b l y e a l u a b l en u t r i t i o n r e s o u r c e f o r ma n k i n d.讲座高 效 液 相 色 谱 讲 座高效液相色谱基本参 数和基础理论（下）张玉奎 李秀珍*卢佩章（
44、中国科学院大连化学物理研究所）2-5 分离效能总指标分离度K 1 和R1 定义：任何色谱过程的目的是要分离某一混合物中诸组分。混合物中各组分要分离得好，一是色谱峰要窄，即2t 1/2 或2V 1/值要小；二是两峰间的距离要大。前者是如何选择最佳操作条件，提高柱效率的问题，即色谱动力学问题。后者是如何选择固定相、流动相，改善物质在两相间的分配（吸附）问题，即热力学问题。两者缺一都不能实现有效的分离。而不同“物质对”分离的好坏与难易，表现在总分离效能指标K 1 或R值的大小上。K 1 值的定义为：相邻两峰保留时间之差与各自 半宽度之和的比值。R的定义为：相邻两峰的保留时间之差与各自 底峰宽一半之和
45、的比值。其数学表达式为（参见图2-5）对两相邻峰，t 1/2）t 1/2（=t1/2，故有由式（2-2 4）及式（2-2 6）可得：Wb 1.6 9 8 5(2 t 1/2)代入式(2-3 9)并整理可得K1 与R间的关系式R 0.5 9 K1(2-4 0)2.K 1 与 ,及N 之间的关系：由 K 1值的定义可得：式中N 1 为“物质对”中出峰较早的峰的柱效。由式（2-1 3）及（2-1 4）将（2-4 2）式代入式（2-4 1得：同理可得：由式（2-3 5）代 入（2-4 1得：这是式（2-4 1）的特例。由式（2-4 1、2-4 3）和（2-4 0可知，两峰分离的必要条件是：两组分在流动
46、相及固定相间有不同的分配比，即k（2/k（1 1。样品组分必须有一定 的保 留值，即k（1 0 色谱柱对所分离的组分必须具有最低的必要的柱效率，即理论塔板数N。3 分析、分离对K1 的要求（1）K 1 与峰分离度K 3 之间的关系要定性判别有一色谱峰，必须具有一定峰分离度，由图（2-5，峰分离度K3 的定义为：K 3=（C m a x(-C i/C m a x(2)(2-4 7)假定流出曲线为高斯峰形，则色谱峰可表达为：对两相邻峰，2 1 2 2，因此两峰相交处两组 分 浓 度 认相 等，则由（2-4 7-6，2-4 7-7，2-4 7-8）和（2-4 7-9）得：由方式（2-4 7-1 2）
47、可以计算出不 同峰 高 比时K 1 与K 3 之间的关系，如表（2-1所示。从表中可以看出，对1 0 0 的两组分，为 得到5的峰分离，其K 1 值要大于1.9 1。图2-6 给出了2 0 个芳烃组分在细内径高效柱上的分离谱图。表2-2 列出了各组分 的表2-1不同 时K 1 与K间的关系名称及有关色谱参数。由表中可以看出，对于不同的“物质对”，当其K1 值（或K 3 值）相近时，相应的 值也很相近，但 值却相差较 大。例如“物 质对”7和 8以 及1 3和1 4峰这两 对“物质对”，其K 1 值分别为 3.0 2和2.8 8,K3 值分别 为9 6 和9 5。此 时两 对物 质的值分别为1.
48、0 2 5 和1.0 2 6，而相应的值为1.1 0 8 和1.0 6 3。可见值用作色谱分离的选择性指标要比 值更为准确和直观。从式（2-4 1）和（2-4 3 可以看出，N 一定时，仅与K 1 值有关，而 值不仅与K1 有关，且与k 有关。因此值不能直接用来作为判断分离情况的依据。表2-3 列出了当峰高比 不同时，为获得5 和9 0 的分离度，对具有不同柱效的色谱柱所要求的值。可以看出，柱效越高，所要求的值越小。从表2-3 可以看出，对于含量为1的物质（即=1 0 0 为获得5 的分离度（其表2-2在1 0厘米 2 毫米内径的 硅胶柱上某些 化合物的色谱参数表2-3不同柱效时所要求 的 值
49、相应的K 1 值为1.9 1 在柱效为9 0 0 0 理论板的色谱柱上，其所需要的值需大于1.0 4 7。4.K 1 与定量分析误差的关系：当两峰相交时，从理论上可导出峰高定量法分析误差P h 与K 1 间的关系（见图2-5）其中e r f(t)是误差函数，定义为由式（2-4 8可知，根据峰高定量分析要求的误差P h 及组分的含量可计算出K1 值，并可进一步由K 1 值及柱效N计算出分析所要求的值。对于峰面积定量法与K 1 的关系，推导如下（参见图2 5：设两相交峰中第 2 号组分数量为q 2，2号峰在1 号峰中的量为 q 2，q 1 为1 号峰在2号峰中的量，前者所造成的误差为P x%=q
50、2/q 2(2-4 8-1)后者所造成的误差为P y=q l/q 2(2-4 8-2)由式（2-4 8-4)可知，当峰高比=1 时，P a=0。当1 时，所需K 1 值随 的增大而显著增加。表2-4 列出了峰高法和峰面积定量法当 值变化时不同的定量精度对K 1 的要求。从表中看出，对含量为1 的物质，其表2-4峰高比 对所要求K 1 值的影响定性分析所要求的K 3 值为5%，此时的K 1 值为1.9 1，对于峰高定量法，如要求 1 的精度，其K 1 值为1.8 3,因此峰高定量应取K 1 1.9 1。2-6 色谱柱的峰容量为使总分离效能指标K1 值能直接与能分析多少组分相关联，采用峰容量P 来