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1、现代化中药制刊发展与中药药理学研究交流会二类中兽药复方中黄柏总生物碱大孔树脂纯化工艺研究刘丽梅,陈琳,王 瑞海,杨立新,刘凤华,许剑琴(l.中国中医科学院中医基拙理论研究所,北京1007的:2.中国中医科学院中药所,北京100700;3.北京农学院 动物科技系,北京102 206;4.中国农业 大学动物医学院,北京10 2206)摘要目的:筛选二类中兽药畜禽抗应激颗粒中黄柏总生物碱大孔树脂纯化l一艺。方法:对黄柏总生物碱提取液纯化所用人孔树脂型号、洗脱剂浓度、大孔树脂吸附容量、上柱药液pH、上柱速度、洗脱剂用量、洗脱剂流速、洗脱液浓缩浓度、洗脱液浓缩后p H进行考察。结果:黄柏总生物碱人孔树脂
2、纯化最佳l一艺为:大孔树脂载样量为A B一8人孔树脂:黄柏药材一1:1.2 9 9一),上样速度为ZBv.h一,5 0%乙醇洗脱,速度15Bv.h一,收集6Bv洗脱液,回收乙醇,浓缩至1.59l挂夸m L一,其相对密度为1.0巧一l.0 l7(7 0),放置室温,浓盐酸调节pH二住2一 0.4,冷藏放置12 h,离心,沉淀低温减压 干燥,得黄柏总生物碱,结果表明,该_艺稳定,质量可控。提取物中盐酸小壁碱含量达到57.3 8%,黄柏总生物碱含量达到5 9一0 4%,符合一类 中搜要的质量要求。结论:该_艺稳定,质量可控,可)月于产业化生产。关键词黄柏;总生物碱;大孔树脂:纯化在兽医临床中发现,由
3、黄柏、苍术、箱香、了:膏以不 同比例组 成的_类中兽药复方I和H,可提高猪对高热环境的适应能力,其中黄柏是 土药。黄柏为芸香科植物黄皮树P he ll od en动飞,nc hine n s e反h nel t I.的 干燥树皮,习称“川黄柏”,具有清热燥湿,泻火除蒸,解毒疗疮等功效川。黄柏含有多种生物碱,二L要为小壁碱,还有巴马J、药根碱、黄柏碱、蝙蝠葛任碱、自瓜萎碱、木兰花碱等生物碱 2 1。资料表明黄柏生物碱具有抗溃疡及抗腹泻作用,对免疫功能具有调节作用I 2,是本课题提取的有效部位。课题在确定了黄柏总生物碱提取l_艺后l 3,采用 人孔树脂纯化,使黄柏总生物碱含量人于提取物的5 0%,
4、以符合二类中兽药的要求,现对纯化l_艺参数的研究报道如 卜。1仪器与试药S PS202OH A U SI七子大平(梅特勒一托利多(常州)称重 设备系统有限公 司),S工入R TO R I U SCP2250大 平(德国),Z D HW电热套(北京中星伟业仪器有限公司),R E一520 5旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器设备有限 公 司),As i le nt110 0高效液相色谱仪(美国)。紫外灯(上海精科实业有限 公 司)二A B一8、D 402 0、S一8人孔树脂(大津南开人学化I_厂),8600 21、DM一130、C D一180、DOOI一SD
5、人孔树脂(山东鲁抗医药股份有限公 司),医川酒精(挚友酒精j一),氯仿,甲醇,氨水均为分析纯。薄层板(烟 台市化学l_业研究所)。黄柏药材购 白河北安国,经中国中医科学 院中药所冯学峰研究员鉴定为芸香科植物黄皮 树P hel lod en动飞nchi nen seS chn ei d.的千燥树皮,其盐酸小壁碱的含量为3.6 5%,符合中国药典200 5版黄柏项卜规定1 1 1。2方法与结果2.1大孔树脂型号的筛选采用 不 同极性7个型号人孔树脂各10 09,按说明!弓要求进 行 处理备用。取同一批黄柏细 丝,按现代化中药制剂发展与中药药理学研究交流会已筛选的提取!_艺I 2,即加药材r o倍量
6、 7 5%乙醇回流提取3次,每次l.s h,药液回收乙醇,浓缩至相对密度为0.99 81.00 5(6 0),加水至药液总体积相当于药材 2 4的倍冷藏过夜,离心,上清液采用不 同型号的大孔树脂纯化,分别用水、1 0%、3 0%、50%、9 5%乙醇或酸醇进行洗脱,收集不同浓度洗脱样品,进行含量测定。采用H PLC法测定盐酸小聚碱百分含量,采用紫外一可见分光光度法测定总生碱百分含量,实验结果见表1。表l各种型号人孔树脂纯化黄柏提取物的筛选结果树脂型号DM一130生药量/g45洗脱剂出膏率/%盐酸小璧碱含量/%总生碱提取率/%2.26*860 021总生碱含量/%0.429.703.6613.9
7、9D40202.06*O八O 八、公 件、以,、,今、.6、4Q八,JJ.i伟、,*S一8CD一1802 57DOO一SD水一1 0%乙醇30%乙醇50%乙醇10%乙醇30%乙醇10%乙醇30%乙醇水一10%乙醇30%乙醇95%乙醇0.1%酸醇10%一95%乙醇0.5%一1 0%酸醇30%乙醇50%+95%乙醇5.73*7.5730.580.31*1.674.825.637.021.884.3 15.4634.746.7530.0 60.83*0.94 1.9 68.2523.9 50.4*16.758.6 96.5241.170.44*38.1120.862 9613.645.59*1.87
8、1.90*1.72A B一8*2.272.97*注:*表示样品出膏率低,未测含量,或总生物碱 含量低,未 计算提取率。实验结果表明,采用AB一8人孔树脂纯化黄柏提取液纯化效果优于其它型号大孔树脂,故实验中采用A B一8大孔树脂进行黄柏提取液的纯化,并对纯化参数进行优化。2.2洗脱剂浓度的筛选及洗脱药液浓缩后p H的确定预实验表 明,1 0%乙醇冲洗可除去一部分杂质,生物碱集中在 3 0%一5 0%之间下样。取黄柏5份,提取纯化,按表31_艺洗脱大孔树脂,按色带收集药液,并用薄层检查至小壁碱痕量,测 定提取物中总生物碱的含茸,结果见表2。表2乙醇洗脱大孔树脂浓度的筛选条件及结果样号_艺出膏率/%
9、总生物碱含结果分析%11 0%除杂质,3 0%乙醇洗5.5 84 23 5总 生物碱含量 高,洗脱体积脱大(24 B v)23 0%乙醇洗脱8.8 11 0.5 0未除杂质,总生物碱含量分50%乙醇洗脱1.0512.0 6散在两部分里(10B V、6B V)35 0%乙醇洗脱7.7 92 4.4 5未除杂质,总生物碱含量低,洗脱体积小(4BV)41 0%除杂质,5 0%乙醇洗6.2 93 9.9 9总生物碱含量 高,洗脱体积脱小(4.SB V)51 0%除杂质,4 0%乙醇洗5.7 73 7.6 4总生物碱含量较高,洗脱体脱积居中(7B V)现代化中药制剂发展与中药药理学研究交流会结果表明,3
10、 0%乙醇冲洗人孔树脂总生物碱含量高,但洗脱体积人,周期长,与之相比,50%乙醇洗脱大孔树脂总生物碱含量略低.,但洗脱体积小,周期短。由于3 0%、50%乙醇浓度洗脱黄柏总生物碱含量均小于5 0%,需进一步纯化。将洗脱药液浓缩后调节pH,生物碱析出,提高含量。为此对3 0%、50%乙醇洗脱液浓缩后的pH进行筛选。取4份等量A B一8人孔吸附树脂,按要求进行预处理,检验合格后备用。取4份黄4 f,按优选l一艺提取并行上柱前纯化,上清液上柱,按表41_艺进行洗脱,按色带收集药液,回收乙醇,浓缩,用浓盐酸调节pH至没有物质析出,放置12 h,离心,沉淀减压 干燥,测定提取物中盐酸小壁碱和总生物碱碱含
11、量,结果见表3。表330%、50%乙醇洗脱大孔树脂样品含量及pH值范围T艺出膏率%盆酸小紧碱含量%盆酸 小璧碱转移率%J总生物碱含量%总生物碱提取率%序号110%Et0H洗4BV弃掉:30%Et0 H洗脱5 7 8%4 9 石6%7 8.6 46 1 95%35824 Bv,浓缩至2.()gm L一,调p H=(,.42300,oEtoH洗脱24Bv,浓缩至一 g翎L一,调4 一50,063.5 80;07 3一67一%2.97PH=023310%Et0H洗4BV弃掉:50%Et0H洗脱5 45%54.87%8 1.936 6 4 2%3石l6.S Bv,浓缩至一sgmL一调p H一(,.31
12、450o oEtoH洗脱65 BV,浓缩至15g mL一,、6290;052 3 70,090.2457乃3?3乃2调p H一0 2 3结果表明:直接用5 0%E to H洗脱,药液回收乙醇后用浓盐酸调节至pH二aZ一0.4,仁物碱完全析出,提取物中盐酸小壁碱转移率和总生物碱提取率最高,且总生物碱含量符合一类中兽药的质量要求,故确定洗脱剂为50%乙醇,洗脱液用盐酸调节至pH二0.2一0.4。2.3大孔树脂吸附容量的考察AB一8大孔吸附树脂10鲍按要求处 理装柱(3、40 cm)备用。取黄柏丝2709,按优选l一艺提取井进行上柱前纯化上清液上柱,上柱速度控制在Z Bv.h一,分段收集流出液,H
13、PL C法检测流出液中盐酸小聚碱的峰面积,绘制吸附容量图,见图l。16 00 014000120000 00 080 006000400020 000一一L.厂厂岑名誊孚岁督以一、掣年载样量jg图l大孔树脂吸附黄柏药液容量图结果表明,10 09人孔吸附树脂吸附13鲍黄柏药材提取的药液时开始渗漏,考虑生产实际情况,该复方l一艺中人孔吸附树脂吸附黄柏量定为1:1.2(g.g一,),即10 09人孔树脂载12 09黄柏药材提取液。2.4药液上柱时pH的考察现代化中药制齐U发展与中药药理学研究交流会取3份A B一8大孔吸附树脂各1009按要求处 理装柱(3x40 cm)备用。取3份黄柏各80 9,按优
14、选1一艺提取并行上柱前纯化,得上清液,测pH=4 万,3份药液l份为原洗脱药液pH=4.5,另外2份洗脱药液用5%氢氧化钠调竹pH=7.5,pH=1 0.5,使3份药液分别在酸性、中性、碱性时上样,按色带收集5 0%乙醇洗脱液6.SB V,回收乙醇,浓缩,浓 盐酸调竹pH二0.2一0.4,放置12 h,离心,沉淀减压干燥,测定提取物中盐酸小壁碱和总生物碱含量,结果见表4。表4上柱药液pH的考察结果样号药液pH出膏率%盐酸小壁碱盐酸小聚碱转总生物碱含量%总生物碱提取率%含量%移率%14 54.265 7.0365.6262.0 42.6427 53.545 7.2 855.5 565 702.3
15、2310.53.605 9,6 558.8 362.942.27实验结果表明,3种不同pH药液上柱洗脱样品中盐酸 小巢碱转移率和总生物碱提取率以pH=4.5时药液上样最佳,故按优选l_艺提取并进行上柱前纯化的上清液可直接上样。2.5药液上柱速度的考察取3份A B一8大孔树脂各10 09按要求处理装柱(3“4Oc m)备用。取3份黄柏药材各1 209,按优选_1一艺提取 井行上柱前纯化,上清液上柱,将上柱速度分别控制在ZBv.h一、4Bv.h一、6Bv.h一,洗脱速度相同(ZBv.h一,),按色带收集5 0%乙醇洗脱液6.SBv,其他同2.5,测定盐酸小壁碱与总生物碱的含量,实验结果见表5。表5
16、黄柏药液上柱速度的筛选结果样仁柱速度出膏率盐酸小璧碱含盐酸小壁碱转移总生物碱含总生物碱提取号Bvh一,一%举%率%量%率%125.2 355.4079.3860.533.17244.9 956.1 176.7060.883 04364名058.197 6.5264.653.10实验结果表明,上柱速度为ZBv.h一时,样品中盐酸小壁碱转移率和总生物碱提取率为最高,故上柱速度选择ZB Vh一。2.6乙醇洗脱大孔树脂用量的考察A B一8人孔树脂100 9按要求处理装柱(340cm)备用。根据吸附容量实验结果,取黄柏1209,按优选l_艺提取井进行上柱前纯 化,上清液_L大孔树脂,按柱体积收集5 0%
17、乙醇洗脱液数份,测定流出液中盐酸小壁碱峰面积,测定结果见表6,根据解析体积和峰面积绘制盐酸小粟碱解析曲线图,见图2。表6洗脱体积与峰面 积测 定结果l“2七3布4#5井6#7#8#体积/BV12345678峰面积/mA U387 95.13 8253.925 446.6294 7.5324.395 7.016.4614.35现代化中药制f r l J 发展与中药药理学研究交流会45 仪)040 0003 50川):飞()(X)025(刃020()0015()0 0I()0()050 000寻厄李督针望令集图2盐酸小璧碱解析曲线图实验结果表明,当50%乙醇洗脱6BV以后,HPLC图谱中盐酸小壁碱
18、峰面积已很小,k 此用50%乙醇洗脱,收集6 BV流出液。2.7洗脱剂流速 的考察取3份A B一8人孔树脂各10 09按要求处理装柱(3x40 cm)备用。取3份黄柏药材各12 09,按优选l_艺提取纯化上清液上柱,上柱速度均为Z Bvh一,洗脱速度分别为0.SBvh一,、】O Bvh一,、1.SBv.h一,收集50%乙醇洗脱液6Bv,其他同上,测定样品中盐酸小壁碱与总生物碱的含量,实验结果见表7。表7人孔树脂卜样洗脱速度的筛选结果总 生物碱提取塾3 0 83 2 6洗脱速度BV由出膏率盐酸小聚碱含量盐酸 小聚碱转总生物碱含量%移率%柱号0.51.0l,559.87561556.0777.91
19、79.9981.2 66 4.7762 7563 293.35、曰09产.勺二,乙4亡,亡实验结果表明,大孔树脂乙醇洗脱速度为】.SBv.h一时,样品中盐酸小聚碱转移率和总生物碱提取率最高,故选择洗脱速度为l.SBv.h一适宜。2.8洗脱液浓缩浓度的考察取AB一8人孔树脂3009按要求处理装柱(6x80cm)备用。取黄柏36 09,按优选一艺提取并进行上柱前纯化,收集50%乙醇洗脱液6Bv,均分为3份,每份洗脱液分别浓缩至不同浓度,加浓盐酸调P H=0.2一0.4,冷藏放置12 h,离心,取沉淀减压干燥,测定样品中盐酸小璧碱及总生物碱含量,结果见表8。表8洗脱液浓缩浓度的筛选结果编号浓度出膏率
20、盐酸小壁碱含盐酸小璧碱转总生物碱含量%总生物碱提取率%gmL一,%量%移率%11.05.05584080.8062.843.1721.55.8752 3784.2257.533.3732.06.234 6.4470.2750 923.17试验结果表明,5 0%乙醇洗脱液浓缩至1.5 9生药m L一时,样品中盐酸小壁碱转移率、总生物碱提取率最高,故工5 0%乙醇洗脱大孔树脂,药液浓缩至1.5 9生药mL一时调 节pH最佳,此时测定其相对密度为1.015一1.0一7(700 C)2.9大孔树脂纯化黄柏总生物碱验证实验取A B一8人孔树脂80 09装柱(6“80 cm)处理备用。取黄柏960 9,按
21、优选一l一艺提取、_上柱前纯化、上柱纯化,测定样品中盐酸小壁碱及 总生物碱含量,结果见表9。现代化中药制剂发展与中药药理学研究交流会表9人孔树脂纯化黄柏总生物碱验证实验编号出膏率盐酸小壁碱含量%盐酸小聚碱转移率%总生物碱含量%总生物碱提取率%2.5 62.813平均2.712.6 9了01工JI4,jt.J00、口,10 9气6了nJ亡J617月n,6勺了,了O八,一八J-6tl27,6亡JOC41仁,气、4O6Q竹z口、J口工J亡J一、一,亡、,八/吃一了0611、4 44 4结果表明,该l_艺稳定,质量 可控。提取物中盐酸小壁碱含量达到 5 7.3 8%,盐酸小壁碱转移率达到7 1.7 7%,黄柏总生物碱含量达到59.0 4%,符合一类中兽药的质量要求。参考文献 l 国家药典委员会.中华人民共和国药典【S 一部,北京:化学!一业 出版社,20 05.21 4 2 王本祥.土编.现代中药药理与临床.大津科学技术出版社,20 04.13 85!3 刘丽梅,王瑞海,陈琳,等.黄柏总生物碱提取方法及一艺研究.中国实验方剂学杂志.200 9.待发表