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1、高效液相色谱 1.概述-发展关于色谱分离方法的研究始于1901年，俄国植物学家 Tswett（茨维特）在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散成三种颜色的6个色带。两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法，在这一方法中把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，石油醚叫做“流动相”。三年后，他将这种方法命名为色谱法色谱法（Chromatography）。色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展，并发展出一个独立的三级学科-色
2、谱学。1952年英国科学家阿切尔马丁、理查德辛格因发明了分配色谱法而共同获得诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。1.概述-色谱分离的特点应用范围广应用范围广 复杂混合物，有机同系物，异构体，手性异构体。气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。分离效率高分离效率高 若用塔板理论数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几千至几十万的塔板数，特别适用于极复杂混合物的分离，且通常收率、产率、和纯度都较高。操作模式多样操作模式多样 可通过选择不同的操作模式，以适应不同样品的分离。灵敏度高灵敏度高 可以检测
3、出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。v色谱分离的几个概念v所有的色谱分离操作均分为：装柱、上样、层析、洗脱。v其中的固定不动的相，称为固定相；v携带试样混合物流过此固定相的流体，称为流动相；v作为流动相的液体或气体，称为洗脱剂；v洗脱时从柱中流出的溶液，称为洗脱液；v加入洗脱剂使各组分分层的操作，叫层析，也叫展开。分离原理v 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。v 不同组分在色谱分离过程中分离情况取决于各组分在两相
4、间的分配系数、吸附能力、亲和力等的差异。常用的固定相（色谱柱填料）硅胶活性炭离子交换树脂大孔吸附树脂氧化铝凝胶纤维素衍生物环糊精聚丙烯酰胺硅胶：应用广泛，适合各类成分氧化铝：主要用于碱性或中性亲脂性成分，如生物碱、甾体、萜类等活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类聚酰胺：主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质等成分吸附色谱凝胶过滤色谱离子交换色谱大孔树脂色谱分配色谱色谱分离法色谱分离法吸附色谱物理吸附：硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱；化学吸附：黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等；半化学吸附：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化
5、学吸附之间。常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。常用的非极性吸附剂：活性炭。凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过色谱、排阻色谱）原理：分子筛作用葡聚糖凝胶（sephadex G）羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)凝胶过滤色谱离子交换树脂法原理：可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂 从柱上洗脱下来，实现物质的分离。吸附规律 阳离子交换树脂分离碱性成分 阴离子交换树脂分离酸性成分大孔吸附树脂v吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂（非极性）v吸附力：范德华力或氢键v工艺流程：树脂预处理树脂上柱药液上柱树脂的解吸树脂的清洗、再生。分配色谱原
6、理：被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同。正相分配色谱：流动相极性固定相极性正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占6070。液相色谱类型高效液相色谱仪的应用1.环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多环芳烃、多环联苯，阴离子表面活性剂，有机氯农药、有机磷农药，除草剂，酚类胺类，黄曲霉毒素等污染物的分离与鉴定。2.精细化工：在精细化工生产中使用的具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、药物、燃料，工业产品的醛、酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性物质的分离与测定。3.食品、药品质量分析：药物残留，
7、防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定，保健食品中的功效成分检测，真菌毒素分析等。色谱柱简介色谱柱简介正相柱正相柱-固定相通常为硅胶以及其他具有固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团极性官能团胺基团，如胺基团，如（NHNH2 2）和氰基团（）和氰基团（CNCN）的键合相填料。）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（由于硅胶表面的硅羟基（SiOHSiOH）或其他极性基团极性较强，因此，）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固
8、定相低，如正被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。已烷，氯仿，二氯甲烷等。反相柱反相柱-固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱极性相对较弱官能团官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料
9、有：常用的反向填料有：C18C18（ODSODS）、）、C8C8（MOSMOS）、）、C4C4（ButylButyl）、）、C6H5C6H5（PhenylPhenyl）等。）等。化学键合相利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。种类非极性键合相：如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任务的80%。中等极性键合相：如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚类）流动相反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O甲醇乙腈乙醇 丙醇异丙醇四氢呋喃 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷乙醚乙酸乙
10、酯异丙醇流动相的选择原则样品易溶，且溶解度尽可能大。化学性质稳定，不损坏柱子。不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。粘度低，流动性好。易于从其中回收样品。无毒或低毒，易于操作。易于制成高纯度，即色谱纯。废液易处理，不污染环境 色谱分离过程理论基础v塔板理论v由马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出v将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间被固定相占据，而另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新
11、的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，其分离效果就越好。柱效率实际工作中，塔板数的计算用下列公式：而理论塔板数的计算公式为：n=L/H 其中L为色谱柱的柱长；H为理论板高度。考虑到组分在死时间内不参与柱内分配，用调整保留时间代替保留时间，得有效塔板数和有效塔板高度：v保留时间保留时间（t R）：）：从进样到某个组分的色谱峰顶点之间的时间间隔v死时间（死时间（t M）：）：不被固定相滞留的组分从进样开始、通过色谱柱、到出现峰最大值所需要的时间。v调整保留时间（调整保留时间（t R）：）：t R=t Rt Mv保留值是色谱过程的基本热力学参数之一。在相同的操作条件下，不同的物质有各自固有的保留时间，因此
12、它也是色谱定性的基本依据。液相色谱图相关术语(1)色谱图相关术语色谱图相关术语:色谱峰色谱峰(Peak):色谱柱流出组分组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线峰底峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰高峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离峰宽峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰 底相交两点之间的距离半半(高高)峰宽峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰 高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离HPLC的图形结果 -色谱图(Chromatogram)色谱图色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产
13、生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.色谱峰色谱峰时间时间(分分)基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值v峰宽峰宽Wb：色谱峰拐点处的两条切线与基线的两个交点之间的距离；v半峰宽半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽，为2.35 ；v相邻色谱峰峰顶之间的距离除以此二色谱峰的平均宽度。用R表示：v分离度v定性定性时要求：R=1.0（相邻两峰分离程度98%）v定量定量时要求：R=1.5（相邻两峰分离程度99.7%，基线分离，作为完全分离的标准）。v一般将R1作为色谱能较好分离的判据。液相色谱图相关术语(2)色谱图相关术语色谱图相关术语:峰面积峰面积(Peak Area):
14、峰与峰底之间的面积,又称响应值标准偏差标准偏差()()(Standard Error):0.607倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰 拖尾 前伸 A B 1/10h h 拖尾因子Tf不对称因子(As)=BA A拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高液相色谱图相关术语(3)色谱图相关术语色谱图相关术语:基线基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线基线飘移飘移(Bas
15、eline Drift):基线随时间定向的缓慢变化基线噪声基线噪声(N)(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动保留时间保留时间(tR)(Retention time)：组分从进样到出现峰 最大值所需的时间噪声和漂移v噪声（N）：在没有样品进入检测器时，基线 在短期内发生的波动。v噪声的来源：固定液的流失、载气的不纯，电 子元件不稳定、温度变化、外磁场干扰等。v基线漂移：基线在一定时间内产生的单向、缓 慢移动。v良好的检测器其噪声与漂移都应很小。流动相脱气的方法v超声波振荡脱气v惰性气体鼓泡吹扫脱气v在线（真空）脱气HPLC用水v专门的纯水机或超纯水机；v二次或三次重
16、蒸水；v市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；v其它途径；流动相溶剂的要求v溶剂对于待测样品 必须具有合适的极性和良好的选择性。v溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。v高纯度 由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。v化学稳定性好v低粘度 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。洗脱方式v等度洗脱用恒定配比的溶剂系统洗脱v梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。化学键合相利用化学反应将不同的有机官能团通
17、过共价键键合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。种类非极性键合相：如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任务的80%。中等极性键合相：如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚类）评价色谱柱好坏的标准1）理论塔板数n2）拖尾因子Tf 3)色谱柱批与批之间的重现性4）pH值的适用范围5）使用寿命对理想检测器的要求v高灵敏度；v适用范围广，对所有组分都有响应；v温度、流动相流速的变化对响应没有影响；v可梯度洗脱，响应与流动相的组成无关；v死体积小；v使用方便、可靠、耐用；v线性范围宽；v响应时间快；紫外检测器（UV）v配置最普遍；v主要
18、用于检测具有-、p 共轭结构的化合物，如芳烃、稠环芳烃等；v灵敏度高；v可用于梯度洗脱 缺点：v只能检测有紫外吸收的样品；（衍生化解决）v对流动相的选择有一定的限制；（截止波长）荧光检测器（FD）v适用于能产生荧光的化合物；v主要用于氨基酸、多环芳烃等样品；v灵敏度极高（比紫外高13个数量级），适用于痕量分析；v可梯度洗脱 缺点：v许多化合物不产生荧光（可衍生化解决）；示差折光检测器（RID）v通用性好；v对糖类分析灵敏度尚可；缺点：v灵敏度低（比紫外低3个数量级）；v不能梯度洗脱（否则，基线会漂移）蒸发光散射检测器（ELSD）v20世纪90年代新开发；v是示差折光检测器的理想替代品，对葡萄糖
19、最小检出量5 ng；v高灵敏；v可梯度洗脱；缺点：v对有紫外吸收的样品，检测灵敏度较低；检测器比较 紫外 荧光示差折光蒸发光散射测量参数吸光度荧光强度折射率质量类型选择型选择型通用型通用型梯度洗脱可以可以不可以可以最小检出量约1 ng约1 pg约1 g0.110 ngHPLC定性、定量分析定性分析利用保留值定性；色谱-光谱联用定性；利用馏分收集器收集 后，再用光谱定性；定量分析归一化少用外标法内标法常用的定量方法标准曲线法,分为外标法和内标法:外标法在液相色谱中用得最多内标法准确，但是麻烦在标准方法中用得最多外标法定量（一）配制一系列已知浓度的标样外标法定量（二）采集不同浓度 标样的色谱图积分
20、,按外标法 定量计算,建立 标准曲线标准曲线内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（二）采集不同浓度 标样的色谱图积分,按内标法 定量计算,建立 标准曲线标准曲线内标法定量（三）对内标物的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当其色谱峰与其它色谱峰分离好校正曲线的检测范围校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误液相色谱仪的基本结构脱气装置高压泵进样阀检测器流动相色谱柱液相色谱的基本流程图保护柱一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中
21、的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。一、流动相的配制1：有机溶剂的过滤 有机膜、水膜2：流动相超声脱气二、样品处理1：样品过滤（过滤装置：一次性注射器；一次性滤头）2：把经过称量、定容、超声处理后的样品溶液，用一次性注射器和滤头过滤后，加入2mL样品管中备用。三、色谱柱的连接将色谱柱按照流动相流动方向安装在仪器上。注意拧紧色谱柱接头。四、放置流动相1：更换清洗瓶中的超纯水，清洗滤头。2：将储存流动相的贮液瓶放置于贮液瓶架上五、开机依次打开：仪器开关计算机电源开关进行联机，进入工作界面六、系统排气根据仪器不同，可分为：自动排气手动
22、排气但均需要在排气之前手动开泵，且排气完成后应立即关泵。七、冲洗流路（进样前的系统准备）作用：平衡活化色谱柱并清除管路中的杂质和残留的水分。步骤：分析样品前先用甲醇或乙腈冲洗流路20min30min。根据流动相的不同选择不同溶液冲洗流路，具体问题具体分析！八、设定分析方法1：设定程序文件（流动相通道、流速、比例、检测器检测波长、分析时间、最高压力、最低压力、柱温等）2：设定分析方法的方法文件（文件名称、时期等）3：待进样环境平衡后，打开检测器的氘灯，检测器开始自检和校正，进行基线检测，待基线平稳后进样分析（手动进样，自动进样）不同软件设置不同，但总体来说，繁杂但不复杂。九、进样分析以自动进样为例：点击进样键后，进行分析方法文件的选择，数据命名以及保存路径的设置，选择进样体积和进样顺序，保存后即可开始进样。十、数据处理1.根据样品的出峰时间定性2.根据样品的峰面积定量十一、工作完成后的必要维护1：冲洗进样系统（50%甲醇清洗）2：冲洗流路和色谱柱