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1、Western blot 技术原理及技术原理及常见问题分析常见问题分析qWestern Blot简介及原理简介及原理qWestern Blot一般流程一般流程qWestern Blot常见问题分析常见问题分析Western Blot 简介：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子
2、的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。Western Blot 基本原理基本原理Western Blot 优点优点p 高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原特异敏感的抗原-抗体反应抗体反应p 1-5ng1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白Western BlotWestern Blot应用应用q目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析Western Blot Western Blot 流程流程l蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS-PAGESDS-PAGE转膜转膜封闭封
3、闭一抗杂交一抗杂交二抗杂交二抗杂交底物显色底物显色蛋白样品的变性蛋白样品的变性2SDS-PAGE上样缓冲液：上样缓冲液：DTT可临用前以可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。冻存。按按1:1比例与蛋白质样品混合，比例与蛋白质样品混合，95100加热加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量，总蛋白量2050g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml100mM Tris-HCl(pH
4、6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚兰溴酚兰20%甘油甘油ddH2OSDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)：阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。性化。q不连续的电泳缓冲体系
5、。qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳Hoeher 电泳系列电泳系列凝胶成分凝胶成分M丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺 神经毒素！MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMED 神经毒素！M过硫酸铵(AP）神经毒素！MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方及分离胶配方表：表：灌制分离胶灌制分离胶 隔绝
6、空气隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%灌制浓缩胶灌制浓缩胶 插入梳子插入梳子 浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品加样槽加样槽蛋白质分蛋白质分子的迁移子的迁移方向方向 1 2 3 M电泳之后凝胶染色扫胶电泳之后凝胶染色扫胶DNR BIS910凝胶凝胶成像系统成像系统注意：注意：做做western blot通常用预通常用预染染maker！转膜要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。转移膜的选择转移
7、膜的选择最常用于最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤的转移膜主要是硝酸纤维素（维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙）膜和聚偏二氟乙烯烯（Polyvinylidene Fluoride,PVDF）膜，）膜，此外也有用尼龙膜、此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似膜的特点相似,主要用于主要用于核酸杂交。核酸杂交。各种膜的详细特点介绍：各种膜的详细特点介绍：湿转系统注意事项：1.胶在负极，膜靠近正极2.保证每层之间没有气泡3.转膜过程产生大量热量，需冰浴夹板海绵滤纸凝胶膜滤纸海绵正极正极负极负极 Hoef
8、er 全能全能型转印系统型转印系统半干转印系统 Hoefer 半干半干转印系统转印系统注意：注意：防止短路！防止短路！转膜后检测（此步可以省略）丽春红染色丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。封闭S作用：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。S封闭剂：5%脱脂奶粉或BSA，或3%明胶溶于TBST Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）室温孵育室温孵育1h1h或或44过夜过夜注：注
9、：Tween-20Tween-20的作用：减少非特的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。结合。一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。6.加入显色底物进行显色反应。加入一抗，室温孵育1-2小时或4过夜洗膜洗膜加入二抗，室温孵
10、育1-2小时或4过夜洗膜洗膜显色显色不同标记的二抗及成像方法不同标记的二抗及成像方法125125I I标记的抗体标记的抗体X-X-光片压片显色光片压片显色荧光基团标记的抗体荧光基团标记的抗体凝胶成像仪凝胶成像仪不同标记的二抗及成像方法不同标记的二抗及成像方法酶标抗体酶标抗体 ：如：如HRPHRP（辣根过氧化物酶）、（辣根过氧化物酶）、APAP（碱性磷酸酶）等（碱性磷酸酶）等成像方法成像方法：加酶的底物产生：加酶的底物产生显色显色反应或反应或化学发光化学发光反应反应u 显色反应：显色反应：TMBTMB，CNCN，DABDAB等显色底物等显色底物 优点：方便、便宜，直接成像优点：方便、便宜，直接成
11、像 缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测不能重新剥离检测u 化学发光化学发光显色：显色：标标HRPHRP二抗加二抗加ECLECL底物发光反应压片或底物发光反应压片或CCDCCD成像成像 优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测特异性高、可重新剥离检测灵敏度：二者接近！CCD胶片曝光 压片压片 vs.CCD成像成像压片CCD成像价格便宜，但需要不断投入比较贵，但只需一次投入需要暗室是否有毒？有毒，污染环境无毒，环保 操
12、作复杂简便快速，且可连续曝光不同时间成像质量压片后需要二次成像，图像有一定损失一次拍照，永久保存是否能直接叠加Marker否，需要比对划线是，快速直接叠加动态范围比较小宽，可达到4.6个数量级是否可以定量分析否是，仪器自带分析软件压片实例压片实例压片压片：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在胶片上标出胶片上标出Marker的大概位置的大概位置CCD成像成像 动态范围大，能直接叠加动态范围大，能直接叠加Marker，便于后期图像的处理及分析，便于后期图像的处理及分析Marker直接叠加在化学发光图像上直接叠加在化学发光图像上 Wester
13、n Blot化学发光成像化学发光成像 特推荐东胜创新经营特推荐东胜创新经营DNR公司公司MicroChemi化学发光化学发光检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠 产品产品特点：特点：l高灵敏度：高灵敏度：超亮大光圈镜头、大尺寸科学级超亮大光圈镜头、大尺寸科学级CCD、-60低温制冷三重配置为检测化学发光信号低温制冷三重配置为检测化学发光信号带来高灵敏度、高质量的成像效果带来高灵敏度、高质量的成像效果l一键拍照：一键拍照：整个拍照过程只需点击一个按钮，整个拍照过程只需点击一个按钮，即可获得精准高质图像即可获得精准高质图像l快速叠加快速叠加M
14、arker：落射白光实现样品与落射白光实现样品与Marker的准确定位，方便快速在的准确定位，方便快速在Western的图像上直的图像上直接叠加接叠加Marker l可清洗的样品盘：可清洗的样品盘：可完全抽出清洗，避免样可完全抽出清洗，避免样品间的交叉污染和实验台面的污染，延长仪器的使用品间的交叉污染和实验台面的污染，延长仪器的使用寿命寿命其他成像方法示例其他成像方法示例Western Blot结果分析目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。分析软件如分析软件如GelQuant等等Western Blot常见问题分析常见问题分析SDS-PAGESDS-
15、PAGE电泳电泳电泳电泳uu胶不平？胶不平？胶不平？胶不平？uu凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？胶玻璃板洗刷干净胶玻璃板洗刷干净胶玻璃板洗刷干净胶玻璃板洗刷干净加入加入加入加入APAP和和和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀
16、均匀均匀均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐uu条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？uu“微笑微笑微笑微笑”或或或或“倒微笑倒微笑倒微笑倒微笑”条带？条带？条带？条带？uu条带微弱？条带微弱？条带微弱？条带微弱？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，
17、以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适合适合适合适蛋白浓度不够，加
18、大上样量蛋白浓度不够，加大上样量蛋白浓度不够，加大上样量蛋白浓度不够，加大上样量蛋白样品是否保存良好，不能反复冻蛋白样品是否保存良好，不能反复冻蛋白样品是否保存良好，不能反复冻蛋白样品是否保存良好，不能反复冻融，提取过程防止蛋白降解融，提取过程防止蛋白降解融，提取过程防止蛋白降解融，提取过程防止蛋白降解SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳电泳电泳转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？uu条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？uu单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？单个
19、或多个白点？uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡中浸泡中浸泡中浸泡5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“三三三三明治明治明治明治”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸确保膜
20、和凝胶之间没有气泡确保膜和凝胶之间没有气泡确保膜和凝胶之间没有气泡确保膜和凝胶之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温转移到膜上的蛋白很少1.1.蛋白分子量蛋白分子量 10KD10KD2.2.蛋白的等电点蛋白的等电点 93.3.SDSSDS浓度不合适浓度不合适4.4.凝胶太厚凝胶太厚 原因原因对对策策1.1.蛋白分子量蛋白分子量10KD10KD时，减时，减少转膜时间；使用小孔径少转膜时间；使用小孔径的膜的膜2
21、.2.更换高更换高pHpH值值BufferBuffer3.3.在阴极在阴极bufferbuffer中加入中加入0.005-0.01%SDS 0.005-0.01%SDS 可提可提高转膜效率高转膜效率4.4.延长转膜时间延长转膜时间1.1.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.3.封闭不充分封闭不充分4.4.抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原因原因对对策策1.1.PVDFPVDF膜转膜前用膜转膜前用100%100%甲醇将膜甲醇将膜完全浸湿，转膜前用缓冲液浸完全浸湿，转膜前用缓冲液浸泡泡10min10min2.2.
22、拿取膜与吸水纸时要戴手套，拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液更换新鲜转膜缓冲液3.3.更换封闭剂或延长封闭时间更换封闭剂或延长封闭时间4.4.检测一抗、二抗与封闭剂是否检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应有交叉反应 如有，更换封闭剂或抗体如有，更换封闭剂或抗体5.5.做预实验检测确定一抗、二抗做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度的最佳工作浓度背景太高杂交信号很弱或没有1.1.抗体不适合于抗体不适合于western blot 2.抗体浓度太低浓度太低3.3.抗体保存不当抗体保存不当4.4.抗原不充足抗原不充足5.5.膜的漂洗过度膜的漂洗过度6.6.转膜不充分转膜不充分 原因原因对对
23、策策1.1.设置阳性对照和内参蛋白设置阳性对照和内参蛋白2.2.加大抗体浓度加大抗体浓度3.3.抗体长期保存应在抗体长期保存应在7070，使用前做效价检测，使用前做效价检测4.4.增加蛋白上样量，用已知增加蛋白上样量，用已知标准量蛋白做参照标准量蛋白做参照5.5.减少漂洗的时间和次数减少漂洗的时间和次数1.1.一抗不是唯一特一抗不是唯一特异的异的2.2.二抗出现非特异二抗出现非特异结合结合 原因原因对对策策1.1.制备单克隆抗体或者重新选制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点制备取合成抗原多肽的位点制备抗体抗体2.2.设立不加一抗，只加二抗的设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有平行对照来检测二抗是否有非特异结合非特异结合出现非特异带谢谢大家！谢谢大家！