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1、1聚聚 合合 酶酶 链链 式式 反反 应应Polymerase Chain Reaction PCR博士生导师：王斌博士生导师：王斌2012.10.292012.10.29病原生物学病原生物学2生命现象是自然界最复杂的现象What is life?The feature of the lifeThe life on the Earth科学认识生命3现代生命科学研究的里程碑之一现代生命科学研究的里程碑之一 1839年年 细胞学说细胞学说 19世纪30年代，德国植物学家 施莱登（Matthias Jacob Schleiden，1804-1881）首先指出，所有植物体都是由细胞构成的。他的这个观点
2、被德国动物学家施旺（Theodor Schwann，1810-1882）在动物组织和细胞研究中证实，所有动物也是由细胞构成的。施旺指出：“细胞是有机体，整个动物或植物体乃是细胞的集合体。它们依照一定的规律排列在动物体内。”在此基础上他们创立了细胞学说。4细胞学说将植物学和动物学联系在一起，细胞学说将植物学和动物学联系在一起，论证了整个生物界在结构上的统一性，以论证了整个生物界在结构上的统一性，以及在进化上的共同起源，有力地推动了生及在进化上的共同起源，有力地推动了生物学向微观领域的发展。物学向微观领域的发展。尽管细胞学说的某些部分已成为历史的陈尽管细胞学说的某些部分已成为历史的陈迹，然而其中心
3、思想仍广泛而深刻地影响迹，然而其中心思想仍广泛而深刻地影响了后来生物学的发展，任何生物学的重要了后来生物学的发展，任何生物学的重要问题都必须从细胞中寻求最后的解答问题都必须从细胞中寻求最后的解答.5现代生命科学研究的里程碑之二现代生命科学研究的里程碑之二1859年 Darwin进化论：达尔文（Charles Darwin，1809-1882）发表物种起源指出生物变异的普遍性、变异与遗传的关系，提出了生存竞争和自然选择学说，系统地论述了物种形成的机制。生物变异的普遍性、变异与遗传的关系，提出了生存竞争和自然选择学说，系统地论述了物种形成的机制。6达尔文在1859年出版的物种起源一书中系统地阐述了
4、他的进化学说。其核心自然选择原理的大意如下：生物都有繁殖过剩的倾向，而生存空间和食物是有限的，所以生物必须“为生存而斗争”。在同一种群中的个体存在着变异，那些具有能适应环境的有利变异的个体将存活下来，并繁殖后代，不具有有利变异的个体就被淘汰。如果自然条件的变化是有方向的，则在历史过程中，经过长期的自然选择，微小的变异就得到积累而成为显著的变异。由此可能导致亚种和新种的形成。7达尔文的进化理论还存在着若干明显的弱点：他的自然选择原理是建立在当时流行的“融合遗传”假说之上的。按照融合遗传的概念，父、母亲体的遗传物质可以像血液那样发生融合；这样任何新产生的变异经过若干世代的融合就会消失，变异又怎能积
5、累、自然选择又怎能发挥作用呢？达尔文过分强调了生物进化的渐变性；他深信“自然界无跳跃”，用“中间类型绝灭”和“化石记录不全”来解释古生物资料所显示的跳跃性进化。他的这种观点近年正越来越受到间断平衡论者和新灾变论者的猛烈批评。81871年，达尔文又发表了人类的由来及其性选择，描述了人类进化的过程。他的结论是：“人类和其他物种同是某一种古老、低级、早已灭绝了的生物类型的同时并存的子孙”。伟大革命导师马克思对进化论给予了很高的评价，把它与能量守恒和转换定律、细胞学说并列为19世纪的三大自然科学发现。9一、基因及一、基因及DNA双螺旋结构双螺旋结构二、二、DNADNA复制、转录及翻译复制、转录及翻译三
6、、三、PCRPCR原理原理四、四、PCRPCR操作操作10一、基因及一、基因及DNADNA双螺旋结构双螺旋结构1 1、基因（、基因（genegene）：）：遗传因子，是遗传因子，是DNADNA或或RNARNA分子上具分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列，基因通过指导蛋白质有遗传信息的特定核苷酸序列，基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。个体的性状表现。2 2、基因概念的提出：、基因概念的提出：1919世纪世纪6060年代，遗传学家孟年代，遗传学家孟德尔提出了生物的性状是由遗传因子控制的观点。德尔提出了生物的性
7、状是由遗传因子控制的观点。2020世纪初期，遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验，世纪初期，遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验，认识到基因存在于染色体上，并且在染色体上是呈认识到基因存在于染色体上，并且在染色体上是呈线性排列，从而得出了染色体是基因载体的结论。线性排列，从而得出了染色体是基因载体的结论。11 1865 1865年，孟德尔发表了年，孟德尔发表了植物杂交实验植物杂交实验，首次，首次阐述了生物界有规律的遗阐述了生物界有规律的遗传现象。传现象。“遗传因子遗传因子”19001900年，孟德尔遗传规年，孟德尔遗传规律被证实，成为近代遗传律被证实，成为近代遗传学基础。学基础。遗传学是分子生物学发展
8、的基础123 3、DNADNA双螺旋结构的提出：双螺旋结构的提出：19531953年，年，James Watson和和Francis Crick发现了发现了DNADNA双螺旋的结构，开启了分双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生生命之谜命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。传递的途径。19621962年，共同荣获了诺贝尔生理学或医年，共同荣获了诺贝尔生理学或医学奖。学奖。1314中 心 法 则(The central dogma)microRNA小分子RNANcRN
9、A非编码RNAtRNA&rRNA复制二、遗传信二、遗传信息的传递：息的传递：151 1、复制：、复制：是以母链是以母链DNADNA为模板合成子链为模板合成子链DNADNA的过程。的过程。实质实质是在酶是在酶促作用下，单个的脱氧核苷酸通过促作用下，单个的脱氧核苷酸通过3 3，5 5-磷酸二酯键聚合的过磷酸二酯键聚合的过程。在复制过程中，程。在复制过程中，DNADNA双螺旋解开成为两条单链双螺旋解开成为两条单链(亲代链亲代链)，以每，以每一条单链为模板，按照碱基配对规律，各自合成一条与之互补的一条单链为模板，按照碱基配对规律，各自合成一条与之互补的新链（子代链），形成两个结构和碱基序列完全一致的子
10、代新链（子代链），形成两个结构和碱基序列完全一致的子代DNADNA，其中每一个子代其中每一个子代DNADNA分子中都保留一条来自亲代的链。分子中都保留一条来自亲代的链。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA（一）（一）DNADNA的复制：的复制：半保留复制半保留复制1619581958年，年，Meselson Meselson 和和 Stahl Stahl 证明证明DNADNA半保留复制半保留复制Meselson-Stahl实验(米西尔逊米西尔逊-斯塔尔实验斯塔尔实验)被称为“生物学中最漂亮的实验”17复复制制过过程程简简图图18按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNADNA与与亲亲代代
11、DNADNA的的碱碱基基序列一致。序列一致。2 2、半保留复制的意义、半保留复制的意义 遗传的保守。遗传的保守。物种的稳定。物种的稳定。决定后代的生物学性状和代谢类型。决定后代的生物学性状和代谢类型。19（二）转录：（二）转录：RNARNA的生物合成的生物合成1 1、转录：、转录：生物体以生物体以DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA的过程，即以双链的过程，即以双链DNADNA中中的一条链为模板，以的一条链为模板，以ATPATP、CTPCTP、GTPGTP和和UTP4UTP4种核苷三磷酸为原料，种核苷三磷酸为原料，在在RNARNA聚合酶催化下合成聚合酶催化下合成RNARNA的过程。是的过
12、程。是mRNAmRNA、tRNAtRNA、rRNArRNA等的等的合成步骤，包括起始、延伸、终止合成步骤，包括起始、延伸、终止3 3个步骤。个步骤。20 翻译：翻译：即蛋白质的生物合成，是将核酸即蛋白质的生物合成，是将核酸RNA中密码中密码子破译的方式解读为蛋白质一级结构中子破译的方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基酸的种氨基酸的排列顺序排列顺序。翻译过程从。翻译过程从5-AUG开始，按开始，按mRNA模板模板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。（三）翻译：（三）翻译：蛋白质蛋白质的生物合成的生物合成21221 1、定定义义：聚聚合合酶酶链链
13、反反应应（PCRPCR）是是在在DNADNA聚聚合合酶酶催催化化下下，以以母母链链DNADNA为为模模板板以以特特定定引引物物为为延延伸伸起起点点，通通过过变变性性、退退火火、延延伸伸等等步步骤骤，体体外外复复制制出出与与母母链链模模板板DNADNA互互补补的的子子链链DNADNA的的过过程程。是是一一项项DNADNA体体外外合合成成放放大大技技术术，能能快快速速特特异异地地在在体体外外扩扩增增任任何何目目的的DNADNA。可可用用于于基基因因分分离离克克隆隆，序序列列分分析析，基基因因表表达达调调控控，基基因因多态性研究等许多方面。多态性研究等许多方面。三、三、PCRPCR原理原理 PCR
14、PCR是是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。23l19531953年，年，Watson和和Crick提出提出DNADNA双螺旋结构及双螺旋结构及半保留复制半保留复制模型。模型。l19581958年，年，Meselson和和Stahl用实验证实用实验证实DNADNA半保留复制模型。半保留复制模型。l7070年年代代以以来来，人人们们采采用用两两种种思思路路去去尝尝试试建建立立基基因因的的无无性性繁繁殖殖体体系，一是系，一是基因克隆基因克隆技术，二是技术，二是体外扩增体外扩增技术。技术。l19711971年年，Khorana（美美国国，19681968
15、年年诺诺贝贝尔尔医医学学奖奖得得主主）：“经经过过DNADNA变变性性，与与合合适适引引物物杂杂交交，用用DNADNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重复该过程便可克隆重复该过程便可克隆tRNAtRNA基因。基因。”l核核酸酸体体外外扩扩增增最最早早设设想想被被遗遗忘忘原原因因:（1 1）很很难难进进行行测测序序和和合合成成寡寡核核苷苷酸酸引引物物；（2 2）19701970年年SmithSmith等等发发现现了了IIII型型限限制制性性内内切切酶酶，体外克隆基因已成为可能。体外克隆基因已成为可能。2 2、PCRPCR技术的发展历程技术的发展历程24l19761976年年，台台籍籍科
16、科学学家家钱钱嘉嘉韵韵（Alice Chien）从从黄黄石石国国家家公公园园的的嗜嗜热热菌菌Thermus aquaticus中中分分离离出出对对热热稳稳定定的的Taq DNA聚聚合合酶酶。l19851985年年，美美国国Cetus公公司司人人类类遗遗传传研研究究室室的的Mullis发发明明PCR，Saiki等等首首次次应应用用PCRPCR法法成成功功地地扩扩增增了了人人-珠珠蛋蛋白白的的DNADNA，并并应应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。l19851985年，年，ScienceScience杂志报道了耐热性杂志报道了耐热性DNADNA聚合酶聚合酶 TaqTa
17、q酶酶（生活在温泉中的（生活在温泉中的水生嗜热杆菌水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的内提取到的一种耐热的DNADNA聚聚合酶），整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显合酶），整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。此酶的发现改善，操作大为简化。此酶的发现,预示着分子时代的到来。预示着分子时代的到来。l19891989年被誉为年被誉为“分子年分子年”，列，列PCRPCR为十余项发明之首。为十余项发明之首。l19931993年，年，MullisMullis荣获诺贝尔化学奖。荣获诺贝尔化学奖。253 3、PCRPCR的原理的原理l遗传物质：遗传物质：细胞核细胞核 染色
18、体染色体 DNADNA（脱氧核（脱氧核糖核酸、磷酸链和碱基构成糖核酸、磷酸链和碱基构成)碱基（碱基（A A、T T、C C、G G）是按双链螺旋排列的，）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列顺序决定了生物的多碱基序列的长度和排列顺序决定了生物的多样性。样性。lPCRPCR的基本工作原理：的基本工作原理：以拟扩以拟扩增的增的DNADNA分子为模板，以一对分分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在引物，在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的链延伸直至完成新的DNADNA
19、合成。合成。26lPCRPCR反应的基本成分：反应的基本成分：模板模板DNADNA、特异性引物、特异性引物、热稳定热稳定DNADNA聚合酶、脱氧聚合酶、脱氧核苷三磷酸（核苷三磷酸（dNTPdNTP）、）、Mg2+Mg2+等。等。基本反应基本反应步骤：步骤：变性变性-退火退火-延延伸，最后通过染料，如伸，最后通过染料，如EBEB染色染色DNADNA后在紫外灯下后在紫外灯下显色检出显色检出27 温度与时间的设置：温度与时间的设置：4 4、PCR PCR 的反应流程：的反应流程：l变性温度与时间：变性温度与时间：一般一般93939494，1min1min足以使模板变性，若足以使模板变性，若低于低于9
20、393则需延长时间，但温度过高对酶的活性有影响。则需延长时间，但温度过高对酶的活性有影响。l退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，对于还有靶基因序列的长度，对于2020个核苷酸，个核苷酸，G+CG+C含量约含量约50%50%的引物，的引物，5555作为选择最适退火温度的起点较为理想。作为选择最适退火温度的起点较为理想。按下公式计算：按下公式计算：TmTm（解链温度）（解链温度）4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)；复性温度复性温度=Tm=Tm值（值（5 51010）在在TmTm值
21、允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高和模板间的非特异性结合，提高PCRPCR反应的特异性。一般为反应的特异性。一般为303060s60s。28延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：延伸温度：一般选在一般选在70707575之间，之间，常用温度为常用温度为7272，过高的延过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：延伸反应时间：1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min；3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min；扩
22、增；扩增10kb10kb需延伸至需延伸至15min15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度模板的扩延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。增，延伸时间要稍长些。循环次数：循环次数：循环次数决定循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度，一般选在的浓度，一般选在3040次之间循环次数越多，非特异性次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。产物的量亦随之增多。291234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-35轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋
23、DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍30 PCRPCR的的三三个个反反应应步步骤骤反反复复进进行行，使使DNADNA扩扩增增量量呈呈指指数数上上升升。反反应最终的应最终的DNA DNA 扩增量的计算：扩增量的计算：Y(1X)n Y Y代代表表DNADNA片片段段扩扩增增后后的的拷拷贝贝数数，X X表表示示平平(Y)(Y)均均每每次次的的扩扩增增效效率，率，n n代表循环次数。代表循环次数。平平均均扩扩增增效效率率的的理理论论值值为为100%100%，但但在在实实际际反反应应中中平平均均效效率率达达不不到到理理论论值值。反反应应初初期期，靶靶序序列列DNADNA片片段段的
24、的增增加加呈呈指指数数形形式式，随随着着PCRPCR产产物物的的逐逐渐渐积积累累，被被扩扩增增的的DNADNA片片段段不不再再呈呈指指数数增增加加，而而进进入入线线性性增增长长期期或或静静止止期期，即即出出现现“停停滞滞效效应应”，这这种种效效应应称称平平台台期期数数、PCRPCR扩扩增增效效率率及及DNADNA聚聚合合酶酶PCRPCR的的种种类类和和活活性性及及非非特特异异性性产产物物的的竟竟争争等等因因素素。大大多多数数情情况况下下，平平台台期期的的到到来来是是不不可可避避免的。免的。5 5、PCRPCR的反应动力学的反应动力学31PCRPCR反应曲线反应曲线326 6、标准的、标准的PC
25、RPCR反应体系反应体系1010扩增缓冲液扩增缓冲液1010l l4 4种种dNTPdNTP混合物混合物各各200200mol/Lmol/L引物引物1010100pmol100pmol模板模板DNADNA0.10.12 2g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶2.5u2.5uMgMg2+2+1.5mmol/L 1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至100100l l337 7、PCRPCR产物的检测产物的检测 将反应产物取将反应产物取3-83-8l l作作2.02.0琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳，定性定性检测目的基因的扩增水平。检测目的基因的扩增水平。34四、四、PCRPCR
26、反应特点：反应特点：特异性强：特异性强：遵循碱基配对原则，忠实的复制模板链；遵循碱基配对原则，忠实的复制模板链；灵敏度高：灵敏度高：指数方式增加的，能将指数方式增加的，能将pg(10-12)量级的起始待测量级的起始待测模板扩增到模板扩增到ug(10-6)水平，可从水平，可从 100 万个细胞中检出一个靶细万个细胞中检出一个靶细胞；胞；简便、快速：简便、快速：PCRPCR反应用耐高温的反应用耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶，一次性地将聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在反应液加好后，即在DNADNA扩增液和水浴锅上进行变性扩增液和水浴锅上进行变性-退火退火-延伸延伸反应，一般在反应，一
27、般在2-4h2-4h完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广；一定要用同位素，无放射性污染、易推广；对标本的纯度要求低：对标本的纯度要求低：不需分离病毒或细菌及培养细胞，不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板；均可作为扩增模板；可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的活组织等粗制的DNA扩增检测。扩增检测。35五、五、PCRPCR技术的局限性技术的局限性为了构建特定引物，使特定为了构建特定引物，使
28、特定DNADNA序列的选择性扩序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。需要优化反应条件。PCRPCR技术扩增产物的长度有限。技术扩增产物的长度有限。36六、六、PCRPCR技术的注意事项技术的注意事项防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核材，穿戴手套并经常更换，永远在最
29、后一步才加核酸，液体分装使用等。酸，液体分装使用等。引物设计合理。引物设计合理。TaqTaq酶扩增错误率较高，大约酶扩增错误率较高，大约1/1001/100对碱基对碱基/20/20个循个循环。环。镁离子浓度对反应效率的影响。镁离子浓度对反应效率的影响。仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等。仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等。373839电泳技术带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis,EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1809年俄国物理学家Pece首先发现了电泳现象，但直到1937 年瑞典学者 A.W.
30、K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。40本世纪60-70年代，当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。41电泳的基本原理电泳的基本原理生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。