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1、第第3章章基因工程原理基因工程原理 王金发王金发1 基因工程是20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科2基基因因克克隆隆操操作作3基基因因工工程程的的应应用用45基因工程的对象是基因，所以如果是获得商品的话，就是基基因因的的产产品品，或是改变了遗传性的细细胞胞和个个体体。如果要获得效益的话，除了经济效益之外，还有巨大的社会效益。基因工程的对象是基因，而基基因因要要安安居居才才能能乐乐业业，也就是说基因需要在宿主细胞中工作，这样，基因工程同一般的土建工程的根本差别在于，它它需需要要在在体体外外操操作作，然然后后送送到到细细胞胞中去进行表现中去进行表现。3.1 3.1 基因工程的特点基因工程
2、的特点6 3.1.1 基因工程与遗传工程遗遗传传工工程程(genetic engineering)一一词词产产生生于于19世世纪纪20年年代代，是是遗遗传传学学和和工工程程学学相相结结合合的的一一门门技技术术科科学学。借借用用工工程程技技术术上上的的设设计计思思想想,在在离离体体条条件件下下,对对生生物物细细胞胞、细细胞胞器器、染染色色体体或或DNA分分子子进进行行按按图图施施工工的的遗遗传传操操作作,以以求求定定向向地地改改造造生生物物的的遗遗传传性性。遗遗传传工工程程的的概概念念有有广广义义和狭义之分。和狭义之分。广广义义的的遗遗传传工工程程包包括括传传统统遗遗传传操操作作中中的的杂杂交交
3、技技术术和和现现代代遗遗传传操操作作中中的的基基因因工工程程和和细细胞胞工工程程,狭义的遗传工程仅指基因工程。狭义的遗传工程仅指基因工程。7 3.1.2 生物技术生生物物技技术术(biotechnology)又又称称生生物物工工艺艺学学,生生物物工工程程学学。是是根根据据生生物物学学、化化学学和和工工程程学学的的原原理理进进行行工工业业规规模模的的经经营营和和开开发发微微生生物物、动动植植物物细细胞胞及及其其亚亚细细胞胞组组分分,进进而而利利用用生生物物体体所所具具有有的的功功能能元元件件(如如基基因因、蛋蛋白白质质)等等来来提提供供商商品品或或社社会会服服务务的的一一门门综综合合性性科科学技
4、术。学技术。基基因因工工程程、细细胞胞工工程程、酶酶工工程程和和发发酵酵工工程程等是生物技术的主要内容。等是生物技术的主要内容。8 基因工程基因工程(gene engineering)又又 称称 基基 因因 操操 作作(gene manipulation),重重 组组DNA(recombinant DNA)。基基因因工工程程是是以以分分子子遗遗传传学学为为理理论论基基础础,以以分分子子生生物物学学和和微微生生物物学学的的现现代代方方法法为为手手段段,将将不不同同来来源源的的基基因因(DNA分分子子),按按预预先先设设计计的的蓝蓝图图，在在体体外外构构建建杂杂种种DNA分分子子,然然后后导导入入
5、活活细细胞胞,以以改改变变生生物物原原有有的的遗遗传传特特性性,获获得得新新品品种种,生生产产新新产产品品,或或是是研研究基因的结构和功能。究基因的结构和功能。9体外体外操作操作与细与细胞内胞内表达表达10细胞工程细胞工程(cell engineering)应应用用细细胞胞生生物物学学的的原原理理和和方方法法,结结合合工工程程学学的的技技术术手手段段,按按照照人人们们预预先先的的设设计计,有有计计划划地地改改变变或或创创造造细细胞胞遗遗传传性性的的技技术术,以以及及在在体体外外大大量量培培养养和和繁繁殖殖细细胞胞,或或获获得得细细胞胞产品产品,或利用细胞体本身的技术领域。或利用细胞体本身的技术
6、领域。主主要要内内容容包包括括细细胞胞融融合合、细细胞胞拆拆合合、染染色色体体转转移移、基基因因转转移移、细细胞胞或或组组织织培培养养等等。由由于于所所用用细细胞胞的的来来源源不不同同，细细胞胞工工程程又又分分为为微微生生物物细细胞胞工工程程、植植物物细细胞胞工工程程、动动物物细胞工程等细胞工程等。11植物细胞工程12 细胞分泌工程细胞分泌工程 根根据据细细胞胞内内蛋蛋白白质质合合成成和和运运输输理理论论而而发发展展起起来来的的一一项项新新的的细细胞胞工工程程技技术术，主主要要是是通通过过对对基基因因改改造造，如如基基因因缺缺失失、多多效效分分泌泌突突变变、周周质质泄泄漏漏突突变变或或加加接接
7、信信号号肽肽等等措措施施，促促进进基基因因产产物物分分泌泌的的技术。技术。13酶工程酶工程(enzyme engineering)又又称称酶酶技技术术。它它是是围围绕绕着着酶酶所所特特有有的的生生化化催催化化特特性性,结结合合现现代代的的技技术术手手段段,在在体体外外模模拟拟或或在在常常温温常常压压下下生生成成酶酶反反应应的的产产品品以以及及利利用用重重组组DNA技技术术定定向向改改变变酶酶,进进行行酶酶的的修饰修饰,或酶的全人工合成。或酶的全人工合成。其其主主要要内内容容包包括括酶酶的的化化学学修修饰饰、酶酶的的固固定定化、酶反应器等。化、酶反应器等。14蛋白质工程蛋白质工程(protein
8、 engineering)是是更更广广义义上上的的包包括括酶酶工工程程在在内内的的蛋蛋白白质质修修饰饰操操作作,通通过过对对蛋蛋白白质质及及酶酶的的化化学学修修饰饰及及基基因因改改造造获获得得具具有有特特殊殊功功能能的的非非天天然然蛋蛋白白质质的技术。的技术。主主要要是是根根据据蛋蛋白白质质的的结结构构和和功功能能间间的的相相互互关关系系,利利用用基基因因工工程程技技术术,或或用用化化学学方方法法,合合成成基基因因,改改造造基基因因,以以便便合合成成新新的的蛋蛋白白质质,或或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。15发酵工程发酵工程(fermentation
9、engineering)又称微生物工程又称微生物工程,微生物发酵工程。微生物发酵工程。利利用用生生物物,主主要要是是微微生生物物的的某某种种特特定定功功能能,通通过过现现代代化化工工程程技技术术手手段段,生生产产有有用用物物质质,或或把把微微生生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。主主要要内内容容包包括括菌菌种种选选育育,发发酵酵生生产产微微生生物物,或或植植物物细细胞胞的的代代谢谢产产物物,生生产产微微生生物物菌菌体体,最最佳佳培培养养条件的优化组合等。条件的优化组合等。163.2 3.2 基因工程技术的诞生基因工程技术的诞生 3.2.1 3.2.
10、1 基因工程的技术准备基因工程的技术准备 基基因因工工程程技技术术的的诞诞生生不不仅仅依依赖赖于于基基因因分分子子生生物物学学理理论论的的发发展展，同同时时也也有有赖赖于于一一些些重重要要的的分分子子生生物物学学研研究究方方法法的的建建立立。最最重重要要的的技技术术准准备备是是限限制制性性酶酶的的分分离离纯纯化化、DNADNA连连接接酶酶的的分分离离、大大肠肠杆杆菌菌转转化化技技术术的的突突破破。到到19701970年年，这这三三大大技技术术都都已已经经建建立立，“万万事事齐齐备备，只只欠欠东东风风”了了。到到了了1972197219731973年年，两两位位科科学学助助产产士士BergBer
11、g和和CohenCohen将将基基因因工工程接到了人间。程接到了人间。173.2.2 3.2.2 基因工程技术的诞生基因工程技术的诞生18 第一个重组体的构建第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学年，美国斯坦福大学P.Berg等在等在PNAS上发表了题为上发表了题为“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose op
12、eron of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2904-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生。标志着基因工程技术的诞生。19第第一一个个重重组组体体构构建建20 SV40病病毒毒是是猿猿猴猴病病毒毒，是是一一种种直直径径为为450的的球球形形病病毒毒，分分子子量量为为28106道道尔尔顿顿。SV40的的DNA是是环环状状双双链链结结构构，全全长长5243个个碱碱基基对对。SV40DNA上上有有一一个个限限制制性内切酶性内切酶EcoR的切点。的切点。21SV40病毒病毒22当当获获得得二二聚聚体体SV40DNA后后，Berg等等就
13、就证证明明了了环环状状DNA被被内内切切酶酶切切成成线线性性DNA后后能能够够重重新新环环化化，并并且且能能够够同同另另外外的的分分子重组。子重组。于于是是他他们们进进行行第第二二步步的的实实验验就就是是从从dvgal DNA中中制制备备含含有有E.coli的的半半乳乳糖糖操操纵纵子子DNA，用用上上述述同同样样的的方方法法进进行行重重组连接，并获得成功。组连接，并获得成功。23 第一个有功能重组体的构建第一个有功能重组体的构建虽然虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。分子具有生物学功能。1
14、973年，等在美国年，等在美国PNAS上发表了题为上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,and R.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70:3240-3244,1973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达进行表达,从而完善了从而完善了Berg开创的基因重组技术。开创的基因重组技术。24Boyer and Cohen25质粒质粒 pS
15、C101的获得的获得In 1972,Cohen constructed a new plasmid beginning with DNA isolated from E.coli.Cohen named the plasmid pSC101(“SC for Stanley Cohen).The new plasmid had three important features:(1)it had only a single recognition site where EcoRI would cut the molecule,thus identifying the spot where the
16、 plasmid would open;(2)(2)it had a sequence of nucleotides called an origin of replication,which is needed to initiate DNA replication;such a sequence stimulates plasmids to multiply in a host organism;(3)(3)it contained a gene for resistance to the antibiotic tetracycline;thus,bacteria having the p
17、lasmid could resist the effects of tetracycline,whereas bacteria lacking the plasmid would be killed by the tetracycline.Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献26pSC101质粒质粒DNA27质粒质粒 pSC101对大肠杆菌的转化技术突破对大肠杆菌的转化技术突破 Another key characteristic of Cohens plasmid was the ease of inserting it to a host cell.Cohen fou
18、nd that he could insert plasmids to fresh bacteria by suspending the latter in cold calcium chloride,then rapidly heating the bacteria to 42oC.So treated,the bacterial wall and plasma membrane open to permit the plasmids to pass through and into the cytoplasm.Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献28Cohen与与Boy
19、er合作创建重组合作创建重组DNA分子分子 To some historians,the discipline of DNA technology came into being over pastrami sandwiches at a local delicatessen in Waikiki Beach.The year was 1972.It happened that Herbert Boyer was at a scientific conference in Hawaii speaking about the EcoRl restriction enzyme.Stanley Co
20、hen was in the audience.After the presentation,Cohen invited Boyer to lunch to explore their possible collaboration on a series of experiments.The two researchers sat and considered the experiments that would send DNA technology into a new era.Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献29Cohen与与Boyer合作创建重组合作创建重组DN
21、A分子分子Cohen had been conducting fruitful experiments with plasmids,but he was experiencing difficulty cutting open the plasmids.Boyers EcoRI enzyme seemed to be the ideal solution,so Cohen suggested they join forces.They would use his plasmids and Boyers enzyme to recombine the plasmid DNA.First they
22、 would try to recombine two plasmids to form a single plasmid.If successful,they would attempt to bring DNA from a foreign species into the plasmid to produce a recombinant DNA molecule.Boyer agreed,and the bargain was struck.Cohen在重组在重组DNA技术中杰出贡献技术中杰出贡献30Boyer and Cohen 的策略的策略31pSC102,体内构建的重组体体内构建的
23、重组体他他 们们 首首 先先 检检 查查 了了 EcoR对对 质质 粒粒pSC101和和R6-5的的切切割割情情况况，发发现现EcoR在在质质粒粒pSC101上上只只有有一一个个切切点点，在在质质粒粒R6-5上上有有12个个切切点点,这这样样就就可可以以用用pSC101作作为为重重组组DNA的载体分子。的载体分子。32 他他们们用用EcoR处处理理过过的的和和没没有有处处理理过过的的 质质粒粒pSC101和和R6-5DNA分别转化分别转化E.coli C600,得到下表的实验结果得到下表的实验结果 表：环状和线状质粒表：环状和线状质粒DNA的转化的转化质粒质粒DNA每每g DNA转化子转化子四
24、环素四环素卡那霉素卡那霉素氯霉素氯霉素pSC101(未切割未切割)3105-(EcoR切割切割)2.8104-R6-5(未切割未切割)-1.31041.3104R6-5(EcoR切割切割)51102410133 他他们们从从用用EcoR处处理理的的R6-5的的卡卡那那霉霉素素抗抗性性平平板板上上选选择择了了一一个个克克隆隆，并并检检查查了了它它的的抗抗性性，发发现现该该克克隆隆同同时时具具有有磺磺胺胺的的抗抗性性，但但没没有有氯氯霉霉素素、四四环环素素的的抗抗性性。然然后后从从该该克克隆隆中中分分离离了了一一个个环环状状质质粒粒DNA，命命名名为为pSC102，分子量大约为，分子量大约为171
25、06。34接接着着用用EcoR分分别别切切割割pSC102 和和R6-5质质粒粒DNA，进进行行电电泳泳检检查查，发发现现pSC102被被切切成成三三个个片片段段，相对于质粒相对于质粒R6-5的的EcoR酶切片段酶切片段、和和。这这些些结结果果说说明明不不同同的的酶酶切切片片段段转转化化大大肠肠杆杆菌菌后后能能够够在在细细胞胞内内进进行行重重组组连连接接形形成成有有功功能能的的重重组组质质粒粒。这这一一结结果果也也提提示示，如如果果能能够够在在体体外外重重组组成成功功，并并能能将将重重组组体体引引入入细细胞胞内内，同同样样具具有有生生物学功能。物学功能。35 pSC105，体外构建的重组体，体
26、外构建的重组体作作者者为为了了获获得得体体外外构构建建的的重重组组体体，分分别别用用EcoR切切割割质质粒粒pSC101 和和pSC102,然然后后加加入入DNA连连接接酶酶进进行行连连接接后后转转化化大大肠肠杆杆菌菌，在在四四环环素素和和卡卡那那霉霉素素双双抗抗性性的的平平板板上上检检查查重重组组情情况况，同同时时设设计计一些合理的对照实验。一些合理的对照实验。36 质粒质粒DNA抗生素抗性的转化频率抗生素抗性的转化频率四环素四环素卡那霉素卡那霉素四环素四环素卡那霉素卡那霉素未用酶处理未用酶处理210511052102EcoR处理处理1.21041.11037101 EcoR+DNA连接酶连
27、接酶1.21041.31035.7102表：质粒表：质粒pSC101 和和pSC102混合混合DNA的的 大肠杆菌大肠杆菌C600的转化的转化37pSC101与与RSF1010的共整合的共整合:pSC109的构建的构建象象pSC101一一样样，质质粒粒RSF1010上上也也只只有有一一个个EcoR切切点点，所所以以只只要要用用EcoR分分别别处处理理质质粒粒RSF1010和和pSC101，然然后后用用DNA连连接接酶酶将将两两个个线线性性DNA连连接接起起来来转转化化大大肠肠杆杆菌菌，得得到到一一个个具具有有三三种种抗抗性性的的重重组组质质粒粒 四环素抗性、链霉素抗性、磺胺抗性。四环素抗性、链
28、霉素抗性、磺胺抗性。这这种种重重组组说说明明两两个个复复制制子子能能够够重重组组，并并能能在在细细胞胞内内表达。表达。38 3.2.3 3.2.3 基因操作基因操作的基本过程和特点的基本过程和特点基因操作的基本过程基因操作的基本过程 涉涉及及的的过过程程可可用用分分/合合成成、切、连、转、选、鉴六个字表示。切、连、转、选、鉴六个字表示。39外源外源基因基因的克的克隆与隆与表达表达40基基因因工工程程的的技技术术组组合合41基因工程的特点基因工程的特点基基因因工工程程有有两两个个基基本本的的特特点点分分子子水水平平上上的的操操作和细胞水平上的表达作和细胞水平上的表达。基基因因工工程程技技术术的的诞诞生生使使人人们们能能够够在在试试管管里里进进行行分分子子水水平平上上的的操操作作，象象一一项项工工程程那那样样，进进行行按按图图施施工工的的操操作作，构构建建在在生生物物体体内内难难以以进进行行的的重重组组体体，然然后后将将重重组组的的遗遗传传物物质质引引入入相相应应的的宿宿主主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这这实实际际上上是是进进行行无无性性繁繁殖殖，即即克克隆隆，所所以以基基因因工程通常又称为基因克隆工程通常又称为基因克隆。42基因工程的基础与应用基因工程的基础与应用43