基因工程原理与技术.ppt

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1、第三章第三章 基因工程载体基因工程载体 载体载体(vector)是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的的“运载工具运载工具”，其本质是，其本质是DNA复制子。复制子。必备基本条件必备基本条件：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自主复制；能在宿主细胞内进行独立和稳定的自主复制；具有合适的限制性内切酶位点；具有合适的限制性内切酶位点；具有合适的选择标记基因。具有合适的选择标记基因。根据根据来源和性质来源和性质不同载体可分为不同载体可分为质粒载体质粒载体、噬菌体载体噬菌体载体、黏黏粒载体粒载体、噬菌粒载体噬菌粒载体、病毒载体病毒载体、人工染色体人工染色体等。等。根

2、据根据功能和用途功能和用途不同载体可分为不同载体可分为克隆载体克隆载体、表达载体表达载体(标签标签载体、分泌载体载体、分泌载体)、测序载体测序载体、转化载体转化载体、多功能载体多功能载体等。等。根据根据受体细胞受体细胞不同载体分为不同载体分为原核生物载体原核生物载体(大肠杆菌载体大肠杆菌载体)、真核生物载体真核生物载体(酵母载体、植物载体、动物载体酵母载体、植物载体、动物载体)。第一节第一节 质粒载体质粒载体 质粒载体大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，共质粒载体大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，共同具有同具有复制必需区复制必需区、选择标记基因选择标记基因、限制性酶切位点限制性酶切位点(

3、克隆位克隆位点点)。一、质粒的一般生物学特性一、质粒的一般生物学特性 质粒是染色体外能自我复制的小型质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子，大小为分子，大小为1200kb以上。存在于以上。存在于细菌细菌(最广泛最广泛)、放线菌、真菌以及一、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。些动植物细胞中。1、质粒的分子特性、质粒的分子特性 双链环形双链环形DNA(绝绝大多数大多数)、双链线形、双链线形DNA、RNA(酵母的酵母的杀伤质粒杀伤质粒)。提取的质粒有三提取的质粒有三种构型：种构型：闭合环形闭合环形DNA(超螺旋构型超螺旋构型)，开环形开环形DNA，线线形形DNA。2、质粒的复制类型、质粒的复制类型

4、严紧型严紧型：严格受宿主控制，严格受宿主控制，13拷贝拷贝 松弛型松弛型：不严格受宿主控制，不严格受宿主控制，10200拷贝拷贝 质粒的复制类型与宿主有关，如质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中质粒在大肠杆菌中是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与质粒与R1质粒正好相反。质粒正好相反。大多数质粒载体的复制起始区都来源于大多数质粒载体的复制起始区都来源于pMB1质粒质粒，正，正常情况下在宿主细胞中可维持至少常情况下在宿主细胞中可维持至少15个拷贝。个拷贝。氯霉素、或链氯霉素、或链霉素等存在可使质粒的拷贝数达到几千个。霉素等存在

5、可使质粒的拷贝数达到几千个。3、质粒的不亲和性、质粒的不亲和性 质粒的不亲和性质粒的不亲和性(不相容性不相容性)是指在没有选择压力的情况是指在没有选择压力的情况下，两种质粒不能够在同一个宿主细胞中稳定地共存的现象。下，两种质粒不能够在同一个宿主细胞中稳定地共存的现象。见下图见下图 彼此不相容的质粒属于同一个彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群不亲和群(ColE1/pMB1)，而彼此能够共存的亲和的质粒则属于不同的不亲和群而彼此能够共存的亲和的质粒则属于不同的不亲和群(p15A/ColE1或或pMB1)。4、质粒的转移性、质粒的转移性 质粒的转移性质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的是

6、指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。特性。质粒质粒接合型质粒接合型质粒(自我转移质粒自我转移质粒):多属于严紧型多属于严紧型 非接合型质粒非接合型质粒(不能自我转移质粒不能自我转移质粒):多属于松弛型多属于松弛型 质粒的迁移作用质粒的迁移作用是指非接合型质粒在接合型质粒共存时可是指非接合型质粒在接合型质粒共存时可发生转移的现象。发生转移的现象。如如ColE1(必须具备必须具备nic位点位点、mob基因基因)二、理想质粒载体必须具备的条件二、理想质粒载体必须具备的条件 1、天然质粒用作载体的局限性天然质粒用作载体的局限性 分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记分子量高、拷贝数低、

7、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适。不合适。天然质天然质 粒粒相对分子质量相对分子质量拷贝数拷贝数单一酶切位点单一酶切位点选择性标记选择性标记pSC1015.8106（9.09kb）13EcoR ItetrColE14.210620EcoR I大肠杆菌素大肠杆菌素RSF21247.410610EcoR I(BamH I)ampr9.09kb2、理想质粒载体的必备条件、理想质粒载体的必备条件 具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数；具有若干限制性酶的单一酶切位点具有若干限制性酶的单一酶切位点(多克隆位点多克隆位点，multiple cloning sites，MCS)；多

8、克隆位点多克隆位点(多接头多接头，polylinker，或限制性酶切位点库），或限制性酶切位点库）是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的酶的酶切位点的DNA片段。片段。具有两种以上的选择标记基因；具有两种以上的选择标记基因；缺失缺失mob基因或基因或nic位点；位点；插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。达。三、质粒载体的构建三、质粒载体的构建1、载体构建的基本原则、载体构建的基本原则 根据基因操作的工根据基因操作的工作需要；作需要；符合理想载体的必符合

9、理想载体的必备条件；备条件；选择适合的亲本质选择适合的亲本质粒提供载体元件粒提供载体元件；尽量简化构建程序。尽量简化构建程序。2、pBR322的构建的构建 3个亲本质粒个亲本质粒(见图见图)1、Tn3 转座到转座到pMB1上形成上形成pMB3；2、pMB3的的EcoRI*片段重排形成了片段重排形成了更小的更小的pMB8；3、pSC101的的EcoRI*片段与片段与pMB8的的EcoRI*片段连接形成片段连接形成pMB9；4、Tn3 转座到转座到pMB9上形成上形成pBR312；5、pBR312的的EcoRI*片段重排形成片段重排形成pBR313；6、pBR313的的EcoRII片段重排形成片段

10、重排形成pBR320；7、pBR313的的PstI片段重排形成片段重排形成pBR318；8、pBR320的的PstI和和HincII双酶切片双酶切片段与段与pBR318的的PstI和和HapI双酶连接双酶连接形成形成pBR322。4R1drd19(Tn3)pMB1pMB3pMB8pSC101pMB9pBR312pBR313pBR32011233456pSF2124(Tn3)pBR3187pBR32283、pBR322的改良的改良 进一步降低载体的大小；如进一步降低载体的大小；如pAT153、pXf3等。等。优点：优点：a、失去了、失去了pBR322的的HaeII的两个片段，分子量的两个片段，分

11、子量更小，拷贝数高更小，拷贝数高pBR322的的1.53倍；倍；b、失去了、失去了nic位点，更位点，更安全。安全。pAT153 引入带单一引入带单一EcoRI的选择标记；如的选择标记；如pBR324，具有大肠，具有大肠杆菌素杆菌素E1基因和免疫基因和免疫imm基因基因)、pBR325(氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因)。引入引入lacZ选择标记基因；如选择标记基因；如pUC系列载体系列载体(见下图见下图)引入引入MCS位点；如位点；如pUC系列载体系列载体(见下图见下图)。lacZ基因基因：大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子和：大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子和-半乳糖半乳糖苷酶氨基端苷酶氨基端146个氨

12、基酸个氨基酸(-肽肽)的编码序列。的编码序列。-互补互补：是指载体表达的：是指载体表达的-肽与宿主菌中肽与宿主菌中F因子的因子的lacZM15基因的突变产物结合基因的突变产物结合(-肽与突变肽与突变-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的的C-端片段结合端片段结合)形成具有酶活性的功能蛋白质的现象。形成具有酶活性的功能蛋白质的现象。蓝白斑筛选蓝白斑筛选(-筛选筛选)：是指利用外源基因插入载体上：是指利用外源基因插入载体上lacZ5端的多克隆位点而破坏端的多克隆位点而破坏-互补、不能催化平板培养基互补、不能催化平板培养基中中5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)形成蓝色产物、致形成

13、蓝色产物、致使形成白色的重组菌落而筛选出重组子的方法。使形成白色的重组菌落而筛选出重组子的方法。四、常用的质粒载四、常用的质粒载体类型体类型1、克隆质粒载体、克隆质粒载体 克隆质粒载体克隆质粒载体是指专用于基因或是指专用于基因或DNA片段无性繁殖片段无性繁殖的质粒载体。如：的质粒载体。如：pBR322及其派生质及其派生质粒载体、粒载体、pUC系列系列载体、载体、T载体。载体。pUC质粒载体较质粒载体较pBR322有四个优点有四个优点T载体载体HphI 的识别序列的识别序列T/A克隆克隆2、表达质粒载体、表达质粒载体 表达质粒载体表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源是指专用于在宿主细

14、胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。蛋白质的质粒载体。表达载体表达载体(根据受体细胞根据受体细胞)原核细胞表达载体原核细胞表达载体真核细胞表达载体真核细胞表达载体表达载体表达载体(根据表达蛋白的转运根据表达蛋白的转运)分泌型表达载体分泌型表达载体非分泌型表达载体非分泌型表达载体表达载体表达载体(根据表达蛋白的组成根据表达蛋白的组成)融合型表达载体融合型表达载体非融合型表达载体非融合型表达载体pBV221rrnB 大肠杆菌表达载体的特征大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比与克隆载体相比)：强启动强启动子；如子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子启动子。SD序列；序列；强终止子。如

15、强终止子。如rrnB。制备制备RNA探针的载体探针的载体两条链两条链RNA 探针的制备程序探针的制备程序简化外源蛋白纯化的载体简化外源蛋白纯化的载体(标签载体标签载体)pBAD/His常用的标签常用的标签：多聚组氨酸残基多聚组氨酸残基、结合麦芽糖蛋白结合麦芽糖蛋白、谷胱甘肽谷胱甘肽-s-转移转移酶酶。亲和层析法纯亲和层析法纯化外源蛋白化外源蛋白。BglII site of the MCS.pBAD/His的三种变体的三种变体(3种读码框种读码框)Myc：myc抗体的抗体的抗原决定簇抗原决定簇标签为生物素羧化酶载体蛋白基因标签为生物素羧化酶载体蛋白基因链霉素亲和层析柱3、多功能质粒载体、多功能质

16、粒载体 具有具有克隆克隆、表达表达、测序测序、体外转录体外转录等多种功能，避免了等多种功能，避免了重复操作。如重复操作。如pGEM系列质粒载体：系列质粒载体：4、穿梭质粒载体、穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector)穿梭质粒载体穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。质粒载体。如：如：大肠杆菌大肠杆菌-土壤农杆菌土壤农杆菌穿梭质粒载体穿梭质粒载体(植物转化载体植物转化载体)、大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母酿酒酵母穿梭质粒载

17、体穿梭质粒载体(见下图见下图)、大肠杆菌大肠杆菌-枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌大肠杆菌-动动物细胞物细胞穿梭质粒载体穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌，但还没有大肠杆菌-植物植物细胞穿梭质粒载体。细胞穿梭质粒载体。第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体一、一、噬菌体载体的生物学特性噬菌体载体的生物学特性 1、噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期 2、噬菌体的基因组结构和功能噬菌体的基因组结构和功能 cos位点位点(cohesive-end site)：DNA环环化时其粘性末端形成化时其粘性末端形成的双链区段的双链区段.左侧区：左侧

18、区：AJ，约约20kb 右侧区：右侧区：NR，约约12kb中间区：中间区：JN，约约18kb，为非为非必须区段必须区段cI 基因控制溶源过程，阻遏基因控制溶源过程，阻遏溶菌周期所有基因的表达溶菌周期所有基因的表达3、噬菌体的噬菌体的DNA复制复制 裂解周期的早期裂解周期的早期：型双向复制型双向复制，产生，产生环状环状DNA分子分子；裂解周期的晚期裂解周期的晚期：型滚环复制型滚环复制，产生，产生线性多聚体线性多聚体DNA分子分子。5二、二、噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建1、构建、构建噬菌体载体的基本原理噬菌体载体的基本原理 野生型野生型噬菌体不适于用作载体噬菌体不适于用作载体：DNA基因组大，

19、具基因组大，具有常用限制性核酸内切酶的识别位点多个有常用限制性核酸内切酶的识别位点多个(如如5个个BamHI位点、位点、6个个BglII位点、位点、5个个EcoRI位点、位点、7个个HindIII位点等位点等)；噬噬菌体具有菌体具有包装限制包装限制，外壳只能接纳一定长度，外壳只能接纳一定长度(即相当于即相当于基因基因组大小的组大小的75105)的的DNA分子，只能克隆的外源分子，只能克隆的外源DNA片片段。段。对野生型对野生型噬菌体的改造噬菌体的改造：切除掉切除掉DNA的非必需区段；的非必需区段；除去除去DNA必需区段中的限制酶识别位点，在非必需区引必需区段中的限制酶识别位点，在非必需区引入合

20、适的限性酶位点；入合适的限性酶位点；引入适当的选择性标记；引入适当的选择性标记；在某些在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体。必需基因中引入无义突变使之成为安全载体。2、构建、构建噬菌体载体的基本内容噬菌体载体的基本内容 除去多余的限制酶识别位点除去多余的限制酶识别位点 利用大肠杆菌限制与修饰系统，采用体内遗传重组技术。利用大肠杆菌限制与修饰系统，采用体内遗传重组技术。例如，例如，将将噬菌体在噬菌体在EcoRI限制限制-修饰的宿主和修饰的宿主和EcoRI限制限制-修修饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了EcoRI酶切位点的酶切位

21、点的噬菌体。然后将突变体同野生型噬菌体。然后将突变体同野生型噬菌体噬菌体在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有12个个EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。酶切位点的重组体噬菌体。根据克隆位点数，可将根据克隆位点数，可将噬菌体载体分为噬菌体载体分为插入型载体插入型载体(insertion vectors)和和取代型载体取代型载体(replacement vectors，置置换型载体换型载体)。插入型载体插入型载体：只具有：只具有一个克隆位点一个克隆位点可供外源可供外源DNA插入插入的的噬菌体载体。噬菌体载体。克隆容量较小克隆容量较小，一般在，一般在10

22、kb以内，用于以内，用于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆的克隆。根据噬菌斑的混浊和清根据噬菌斑的混浊和清亮来区分重组体亮来区分重组体 取代型载体：取代型载体：具有成对的克隆位点以使两个位点之间的具有成对的克隆位点以使两个位点之间的 DNA区段可以被外源区段可以被外源DNA片段取代的片段取代的噬菌体载体。噬菌体载体。克隆容克隆容量较大量较大，20kb左右，常用来构建高等真核生物的基因组文左右，常用来构建高等真核生物的基因组文库库。切除掉切除掉DNA的非必需区段的非必需区段 按野生型按野生型DNA分子长度为分子长度为 48kb计算，计算，噬菌体的包装上噬菌体的包装上限是限是 51kb，而必需，

23、而必需DNA区段约区段约28kb，因此，因此，载体克隆外源载体克隆外源DNA的的理论极限值是理论极限值是23kb。包装限制是对重组体的一种正选包装限制是对重组体的一种正选择择(见下图见下图)。引入适当的选择标记引入适当的选择标记 在在噬菌体载体的非必需区段插入噬菌体载体的非必需区段插入LacZ基因基因，其中带有，其中带有多克隆位点。多克隆位点。引入无义突变引入无义突变 在裂解周期的必需基因内引入无义突变，在裂解周期的必需基因内引入无义突变，噬菌体便只能噬菌体便只能在具有无义突变抑制基因的大肠杆菌宿主中存活。如在具有无义突变抑制基因的大肠杆菌宿主中存活。如Charon 4A是在晚期基因是在晚期基

24、因A、B中引入了琥珀突变中引入了琥珀突变。BamHI三、常用的三、常用的噬菌体载体噬菌体载体 1、Lac Z基因基因失活的插入型载体失活的插入型载体 如：如：gt11、gt1823、Charon2、Charon16A等。等。2、免疫功能免疫功能(cI基因基因)失活的插入型载体失活的插入型载体 如：如：gt10、NM1149及及Charon6、Charon7等。等。3、Charon系列系列取代型载体取代型载体 如：如：Charon3235、Charon40、Charon21A等。其等。其MCS含有含有EcoRI、SacI、SmaI、XbaI、SalI、PstI、HindIII、BamHI 4、E

25、MBL系列系列取代型载体取代型载体 如：如：EMBL3、EMBL4、EMBL3A等。等。5、Spi-选择选择取代型载体取代型载体 野生型野生型噬菌体不能在在噬菌体不能在在P2噬菌体的溶源菌中生长，即为噬菌体的溶源菌中生长，即为Spi+表型表型。当其缺失。当其缺失red、gam基因，就能在基因，就能在P2溶源菌中能生长溶源菌中能生长并形成噬菌斑，便获得并形成噬菌斑，便获得Spi-表型表型。这类载体的中间填充片段上都具有这类载体的中间填充片段上都具有red、gam基因，当中间基因，当中间填充片段被外源填充片段被外源DNA取代后，重组体便能在取代后，重组体便能在P2溶源菌中生长并溶源菌中生长并形成噬

26、菌斑，而非重组体则不能在形成噬菌斑，而非重组体则不能在P2溶源菌中生长，这种筛选溶源菌中生长，这种筛选重组体的方法称为重组体的方法称为Spi-选择选择。6、ZAP插入型载体插入型载体 在在ZAP中，含有一个中，含有一个pBluescript噬菌粒的噬菌粒的DNA片段片段(见下见下图图)，位于，位于J基因和基因和cI基因之间，两侧是基因之间，两侧是f1复制起始子和终止子复制起始子和终止子，在辅助噬菌体在辅助噬菌体M13或或f1存在下，能获得带外源存在下，能获得带外源DNA的噬菌粒，的噬菌粒，用于测序和限制图谱构建等用于测序和限制图谱构建等(其它其它载体的缺陷载体的缺陷)。第三节第三节 单链单链D

27、NA噬菌体载体噬菌体载体 M13、f1、fd是一类丝状大肠杆菌噬菌体，都含有同源是一类丝状大肠杆菌噬菌体，都含有同源性很高的单链环状的性很高的单链环状的DNA分子。目前，以分子。目前，以M13噬菌体构建出噬菌体构建出一系列单链一系列单链DNA 噬菌体载体。噬菌体载体。优点优点：它们不存在包装限制问题，能包装它们不存在包装限制问题，能包装6倍基因组倍基因组长的长的DNA分子，克隆容量大。分子，克隆容量大。制备单链制备单链DNA分子，用于分子，用于基因定点突变、基因测序、杂交探针制备等。基因定点突变、基因测序、杂交探针制备等。容易地测定容易地测定出外源出外源DNA片段的插入方向。片段的插入方向。可

28、从大肠杆菌中制备双链可从大肠杆菌中制备双链的复制型的复制型DNA，如同质粒一样，能在体外进行基因克隆操，如同质粒一样，能在体外进行基因克隆操作。作。其两种形式的其两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大肠杆分子都能够转染感受态的大肠杆菌，或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。菌，或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。一、一、M13噬菌体的一般生物学特性噬菌体的一般生物学特性 1、M13噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构 基因基因VIII和基因和基因III、基因基因II和基因和基因IV之间的间之间的间隔区较长，其他基因间隔隔区较长，其他基因间隔区只有数个核苷酸。区只有数个核苷酸。虽然基因虽然基因II和基因

29、和基因IV之间的间隔区之间的间隔区(507nt)包含有复制和转包含有复制和转录的调控序列，但录的调控序列，但外源外源DNA在此插入，并不影在此插入，并不影响噬菌体响噬菌体DNA的复制。的复制。2、M13噬菌体感染、复制及包装噬菌体感染、复制及包装 M13噬菌体的繁殖并不噬菌体的繁殖并不会导致宿主细胞发生溶会导致宿主细胞发生溶菌，但会减慢其生长。菌，但会减慢其生长。基因基因II基因基因二、二、M13噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建 M13mp1是构建的第一个是构建的第一个M13噬菌体载体，是在噬菌体载体，是在M13噬噬菌体的菌体的IG区段的区段的BsuI限制酶切位点上插入了大肠杆菌的限制酶切位点

30、上插入了大肠杆菌的lacZ序列，但仅具有基因工程中不常用的序列，但仅具有基因工程中不常用的AvaII、BglII、PvuI的单一酶切位点及的单一酶切位点及PvuII三个酶切位点。三个酶切位点。M13mp2 是利用点突变把是利用点突变把M13mp1的的 -肽的第肽的第5个氨基个氨基酸密码子中的鸟嘌呤转换成腺嘌呤，从而引入了一个酸密码子中的鸟嘌呤转换成腺嘌呤，从而引入了一个EcoRI限制酶切位点。限制酶切位点。M13mp3 同样是在同样是在M13mp1的的 -肽的第肽的第119密码子位置密码子位置引入一个引入一个EcoRI限制酶切位点。限制酶切位点。M13mp711、M13mp18和和M13mp1

31、9等是在等是在M13mp2的的EcoRI位点引入人工合成的多克隆位点。位点引入人工合成的多克隆位点。M13mp7的的MCS呈呈对称排列对称排列,而其他而其他的呈非对称排列的呈非对称排列,这样用两种酶消化这样用两种酶消化会产生两种末端的会产生两种末端的DNA片段片段.三、三、M13噬菌体载体的主要用途噬菌体载体的主要用途 DNA 测序；测序；基因定点突变；基因定点突变；探针制备。探针制备。四、四、M13噬菌体载体的缺点噬菌体载体的缺点 插入的外源插入的外源DNA片段不稳定，片段越大，越容易发生片段不稳定，片段越大，越容易发生缺失或重排。一般情况下其有效的最大克隆能力仅。缺失或重排。一般情况下其有

32、效的最大克隆能力仅。理论上理论上M13噬菌体载体克隆外源噬菌体载体克隆外源DNA片段有两种插入片段有两种插入方向，但实际上外源方向，但实际上外源DNA总是按一种主要的取向插入的。总是按一种主要的取向插入的。五、噬菌粒载体五、噬菌粒载体 噬菌粒载体噬菌粒载体是一类含有单链噬菌体是一类含有单链噬菌体(M13)复制起点的质复制起点的质粒载体。粒载体。噬菌粒载体的优点噬菌粒载体的优点：分子量较小，约为分子量较小，约为3kb，可克隆，可克隆10kb的外源的外源DNA片片段。段。在宿主细胞内可按质粒在宿主细胞内可按质粒DNA复制，形成的双链复制，形成的双链DNA既稳定又高产。当辅助噬菌体存在时，按既稳定又

33、高产。当辅助噬菌体存在时，按M13噬菌体的滚噬菌体的滚环复制模型进行复制产生单链环复制模型进行复制产生单链DNA分子。分子。具有多种功能。如基因具有多种功能。如基因克隆、基因定点突变、克隆、基因定点突变、DNA测序、体外转录等测序、体外转录等 在多克隆位点的两在多克隆位点的两侧具有侧具有T7噬菌体启噬菌体启动子动子，可进行体外，可进行体外转录。转录。第四节第四节 黏粒载体黏粒载体(cosmid vector)黏粒载体黏粒载体是一类含有是一类含有噬菌体噬菌体cos序列序列的质粒载体。又称柯的质粒载体。又称柯斯质粒载体。斯质粒载体。一、黏粒载体的特点一、黏粒载体的特点 具有具有噬菌体的体外包装、噬

34、菌体的体外包装、高效感染高效感染等特性。当然黏等特性。当然黏粒载体本身不能在体外被包装，只有在克隆了合适长度的外粒载体本身不能在体外被包装，只有在克隆了合适长度的外源源DNA片段，才能被包装成噬菌体颗粒，这是对重组子的片段，才能被包装成噬菌体颗粒，这是对重组子的正选择。正选择。具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性。具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性。黏粒载体的分子量较小，黏粒载体的分子量较小，克隆容量大克隆容量大。按。按噬菌体包噬菌体包装限制装限制(3851kb)，黏粒载体的，黏粒载体的最大克隆容量为最大克隆容量为48kb(如如pHS262)，最低为最低为14kb(如如p

35、JC720)。具有与同源序列的质粒进行重组的能力。具有与同源序列的质粒进行重组的能力。二、黏粒载体的构建二、黏粒载体的构建 黏粒载体都是在通用的克隆质粒载体的基础上，引入黏粒载体都是在通用的克隆质粒载体的基础上，引入cos序列以及其它一些序列构建而成的。如序列以及其它一些序列构建而成的。如pHC79来源于来源于pBR322，pJB8来源于来源于pAT153。此外，此外，引入两个引入两个cos位点，如位点，如c2XB，解决黏粒克隆存，解决黏粒克隆存在的问题；在的问题；在多克隆位点两侧引入一对在多克隆位点两侧引入一对T3、T7噬菌体启噬菌体启动子，制备动子，制备RNA 探针，用于鉴别黏粒文库中的重

36、叠克隆。探针，用于鉴别黏粒文库中的重叠克隆。如如pWE15、pWE16。构建与常用的大肠杆菌质粒载体没构建与常用的大肠杆菌质粒载体没有同源性序列的黏粒载体。如有同源性序列的黏粒载体。如pcos1EMBL，与，与colE1之间缺之间缺乏同源性。乏同源性。导入真核细胞病毒的复制起点及相关选择性标导入真核细胞病毒的复制起点及相关选择性标记，从而构建了大肠杆菌记，从而构建了大肠杆菌-真核细胞的穿梭载体。如真核细胞的穿梭载体。如pWE15、pWE16等。等。三、黏粒克隆的基本程序、存在的问题及解决方案三、黏粒克隆的基本程序、存在的问题及解决方案 黏粒克隆是指应用黏粒载体克隆大片段黏粒克隆是指应用黏粒载体

37、克隆大片段DNA的技术。的技术。1、黏粒克隆的基本程序、黏粒克隆的基本程序2、黏粒克隆存在的问题及解决方案、黏粒克隆存在的问题及解决方案 在连接反应中，黏粒载体片段彼此首尾相连形成多聚在连接反应中，黏粒载体片段彼此首尾相连形成多聚体分子。体分子。解决方案解决方案：一是一是用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；子自身连接；二是二是使用使用Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案黏粒克隆方案(见见下图下图)；三是三是使用使用Bates-Swift黏粒克隆方案黏粒克隆方案(双双cos序列的黏粒序列的黏粒载体载体，见下图见下图)。在连接反应中，酶切的基因组在连

38、接反应中，酶切的基因组DNA片段片段(特别是较小特别是较小的的DNA 片段片段)往往会出现两个或数个片段随机再连接，串联往往会出现两个或数个片段随机再连接，串联地插入到载体上，其连接顺序并不符合基因组中排列顺序。地插入到载体上，其连接顺序并不符合基因组中排列顺序。因此，因此，DNA序列分析结果往往会出现错误。序列分析结果往往会出现错误。解决方案解决方案是将局部消化产物通过凝胶电泳分级分离，获是将局部消化产物通过凝胶电泳分级分离，获得长度为得长度为3145kbDNA片段。片段。Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案黏粒克隆方案Partial Sau3A digestionPhospha

39、tasePartial Sau3A digestion,phosphataseBamHI SmaIBates-Swift黏粒克隆方案黏粒克隆方案四、常用黏粒载体及应用四、常用黏粒载体及应用 常用的黏粒载体常用的黏粒载体：pJB8、c2XB、pHC79、pWE15、pWE16、pcos1EMBL、Charomid系列等。系列等。黏粒载体主要用于真核生物的基因组文库构建。由于其黏粒载体主要用于真核生物的基因组文库构建。由于其克隆容量大，可以减少基因组文库的克隆数，提高筛选时阳克隆容量大，可以减少基因组文库的克隆数，提高筛选时阳性克隆的检出率，大大地减少了工作量。性克隆的检出率，大大地减少了工作量。

40、黏粒载体在以下两种情况下特别有优势黏粒载体在以下两种情况下特别有优势：在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；克隆与分析组成某一基因家族的真核克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段。区段。第五节第五节 其它载体其它载体一、人工染色体一、人工染色体1、酵母人工染色体、酵母人工染色体(YAC)酵母自主复制序列酵母自主复制序列；酵母着丝粒酵母着丝粒；四膜虫端粒四膜虫端粒；酵母选择性标记酵母选择性标记(Trp1、Ura3、Sup4抑制宿主抑制宿主细胞细胞ade2的琥珀突变的琥珀突变)。克隆容量克隆容量：1002000kb SUP411.4 kbYAC的优点的

41、优点：克隆容量大，构建的基因组文库克隆数少，能保持基因克隆容量大，构建的基因组文库克隆数少，能保持基因组特定序列的完整性，有利于制作物理图谱。组特定序列的完整性，有利于制作物理图谱。YAC的缺点的缺点：用其克隆外源基因易出现嵌合体用其克隆外源基因易出现嵌合体(4060的克隆是的克隆是嵌合体，由于重组所致嵌合体，由于重组所致)；某些克隆不稳定，有从插入序列丢失其内部区段的倾某些克隆不稳定，有从插入序列丢失其内部区段的倾向向(由于重组所致由于重组所致)；但可以通过将；但可以通过将YAC文库转化到重组缺失文库转化到重组缺失的宿主来减少嵌合体形成和不稳定性的问题；的宿主来减少嵌合体形成和不稳定性的问题

42、；YAC克隆不容易与酵母自身染色体克隆不容易与酵母自身染色体(15Mb)相分离。相分离。2、细菌人工染色体、细菌人工染色体(BAC)6.9 kb来源于来源于F质粒。质粒。克隆容量克隆容量：300kb优点优点：拷贝数低，稳定，比拷贝数低，稳定，比YAC易分离易分离。3、P1派生人工染色体派生人工染色体(PAC)P1噬菌体载体噬菌体载体PAC载体载体F1 Replicon克隆容量克隆容量：100300kb特点特点：单拷贝，克隆稳定单拷贝，克隆稳定4、哺乳动物人工染色体、哺乳动物人工染色体(MAC)结构组成结构组成：哺乳动物细胞染色体的复制起始区、端粒、哺乳动物细胞染色体的复制起始区、端粒、着丝粒。

43、着丝粒。克隆容量克隆容量：1000kb以上以上 用途用途：研究保证有丝分裂、减数分裂精确进行所需要研究保证有丝分裂、减数分裂精确进行所需要的的DNA片段大小；片段大小；研究哺乳类细胞中染色体的功能；研究哺乳类细胞中染色体的功能；利用利用 MAC的巨大包容性对大而复杂的基因进行克隆的巨大包容性对大而复杂的基因进行克隆和功能分析；和功能分析；用于基因治疗。用于基因治疗。二、植物基因工程载体二、植物基因工程载体 植物转化载体植物转化载体：质粒转化载体、病毒转化载体。：质粒转化载体、病毒转化载体。1、质粒转化载体质粒转化载体 Ti质粒质粒(tumor-inducing plasmid)Ri质粒质粒(r

44、oot-inducing plasmid)2、病毒转化载体病毒转化载体 双链双链DNA病毒转化载体病毒转化载体 花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)克隆位点：基因克隆位点：基因、基因、基因、间隔区、间隔区IR1(见下图见下图)。克隆容量：克隆容量：250bp左右左右 The map of the CaMV genome单链单链DNA病毒转化载体病毒转化载体(双粒病毒双粒病毒)双粒病毒双粒病毒Begomoviruses：两个单链环状：两个单链环状DNA分子，感分子，感染双子叶植物，粉虱传播，如染双子叶植物，粉虱传播，如番茄金花叶病番茄金花叶病毒毒(TGMV)Mastreviruses：1个单

45、链环状个单链环状DNA分子，感分子，感染单子叶植物，叶蝉传播，如染单子叶植物，叶蝉传播，如小麦矮化病毒小麦矮化病毒(WDV)WDV已发展为病毒转化载体，外源基因取代基因已发展为病毒转化载体，外源基因取代基因、基、基因因而不影响其复制。而不影响其复制。TGMV也已发展为病毒转化载体，用外源基因也已发展为病毒转化载体，用外源基因NptII取取代外壳蛋白基因，实现表达。代外壳蛋白基因，实现表达。、RNA病毒转化载体病毒转化载体 基本操作方法基本操作方法：a、病毒、病毒 RNA反转录成单链反转录成单链cDNA；b、单链、单链cDNA合成双链合成双链cDNA；c、将双链、将双链cDNA克隆到质粒、克隆到

46、质粒、Cosmid中；中；d、然后将外源基因插入到克隆在质粒的病毒、然后将外源基因插入到克隆在质粒的病毒cDNA中；中；e、通过体外转录获得病毒、通过体外转录获得病毒-外源基因的外源基因的嵌合嵌合RNA去感染去感染植物。植物。烟草花叶病毒烟草花叶病毒(TMV，见下图，见下图)、马铃薯、马铃薯X病毒病毒(PVX，见，见下图下图)已通过外源基因插入到运动蛋白基因与外壳蛋白基因已通过外源基因插入到运动蛋白基因与外壳蛋白基因之间或取代外壳蛋白基因在植物中表达。之间或取代外壳蛋白基因在植物中表达。Genome map and expression of TMVGenome map and express

47、ion of PVX三、动物基因工程载体三、动物基因工程载体 动物基因工程载体主要是由动物病毒构建的一类载体。动物基因工程载体主要是由动物病毒构建的一类载体。动物病毒侵入动物细胞后，呈现类似于噬菌体的两类生动物病毒侵入动物细胞后，呈现类似于噬菌体的两类生长状态，即裂解感染和整合性感染。长状态，即裂解感染和整合性感染。1、SV40病毒载体病毒载体 取代型载体取代型载体 包括包括早期转录区取代载体早期转录区取代载体和和晚期转录区取代载体晚期转录区取代载体。由于。由于这两个区对病毒感染循环是必需的，因此，必须通过共转化这两个区对病毒感染循环是必需的，因此，必须通过共转化辅助病毒反式补偿这些功能。但最

48、大只能插入的外源辅助病毒反式补偿这些功能。但最大只能插入的外源DNA。混合型载体混合型载体 SV40混合型载体混合型载体是带有是带有SV40复制起点或调控序列及复制起点或调控序列及T抗抗原基因的质粒载体。原基因的质粒载体。T7pcDNA3.15.4kb2、反转录病毒载体、反转录病毒载体 原病毒基因组原病毒基因组病毒基因组病毒基因组PB：复制时引物结合位点；：复制时引物结合位点；：包装信号；：包装信号；gag：结构蛋白；：结构蛋白；pol：反：反转录酶和整合酶；转录酶和整合酶；env：病毒外壳蛋白；：病毒外壳蛋白；LTR：长末端重复序列，含：长末端重复序列，含有启动子、增强子及有启动子、增强子及

49、poly(A)信号等顺式作用序列。信号等顺式作用序列。反转录病毒载体的构建原理反转录病毒载体的构建原理：顺式作用序列是反转录病：顺式作用序列是反转录病毒进行整合、复制所必需的，而反式作用序列不必自身具毒进行整合、复制所必需的，而反式作用序列不必自身具备，可由辅助病毒提供。在构建反转录病毒载体时，保留备，可由辅助病毒提供。在构建反转录病毒载体时，保留病毒基因组的顺式作用序列，用外源基因替代病毒的反式病毒基因组的顺式作用序列，用外源基因替代病毒的反式作用序列，取代的外源作用序列，取代的外源DNA片段可长达片段可长达7kb。用于获得稳定转化的细胞用于获得稳定转化的细胞。3、杆状病毒载体、杆状病毒载体

50、 杆状病毒载体是以杆状病毒载体是以苜蓿银纹夜蛾多角体病毒苜蓿银纹夜蛾多角体病毒DNA为基为基础构建的。础构建的。多角体蛋白对病毒感染和复制是非必需的，其表达水平多角体蛋白对病毒感染和复制是非必需的，其表达水平高，在感染周期晚期可达细胞蛋白的一半以上。因此，可将高，在感染周期晚期可达细胞蛋白的一半以上。因此，可将外源基因插入或取代多角体蛋白基因而构建昆虫细胞高表达外源基因插入或取代多角体蛋白基因而构建昆虫细胞高表达载体。载体。4、痘苗病毒载体、痘苗病毒载体 痘苗病毒基因组结构复杂，长约痘苗病毒基因组结构复杂，长约200kb的线性双链的线性双链DNA，有一个有一个28kb的复制非必需区。的复制非必