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1、第一章第一章 细胞培养的设施与基本条件细胞培养的设施与基本条件 预防培养细胞受到污染是细胞培养成功预防培养细胞受到污染是细胞培养成功与否的关键与否的关键n为什么？生物体内的细胞可以通过机体的代谢、调节和保为什么？生物体内的细胞可以通过机体的代谢、调节和保护等机制而使其营养、环境、生长条件、抵抗有害因子能护等机制而使其营养、环境、生长条件、抵抗有害因子能力等方面处于最佳状况。而体外培养的细胞由于失去了对力等方面处于最佳状况。而体外培养的细胞由于失去了对整体的依赖性，对实验室细胞培养的设施条件和人员素质整体的依赖性，对实验室细胞培养的设施条件和人员素质提出了较高的要求。提出了较高的要求。n为了最大
2、限度的创造既适合于细胞生长又可防治污染的环为了最大限度的创造既适合于细胞生长又可防治污染的环境，在培养过程中对细胞培养的设施、操作规程和检测方境，在培养过程中对细胞培养的设施、操作规程和检测方法等制定了严格的规范要求。法等制定了严格的规范要求。n细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在于，要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他于，要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他有害因子的影响。有害因子的影响。一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。培养、制备、清洗、消毒灭菌处
3、理和储藏。一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。各区最好培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。各区最好分别设置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好分别设置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好能单独设置。如安排在一大实验室内，则无菌操作区能单独设置。如安排在一大实验室内，则无菌操作区与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而培养、制备与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而培养、制备和储藏区位于此两区之间。和储藏区位于此两区之间。动物细胞工程实验室的设置动物细胞工程实验室的设置1.1 细胞工程实验室的设置 有其特殊
4、的设置，如具有光照条件的培有其特殊的设置，如具有光照条件的培养室，试管苗培育所需的温室和移植驯化室养室，试管苗培育所需的温室和移植驯化室等。等。植物细胞工程实验室的设置植物细胞工程实验室的设置基本实验室基本实验室1.1 清洗间清洗间 根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在3050 m2。在实验。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿、用具和培养材料等。室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿、用具和培养材料等。中央实验台还应配置中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大
5、，可以购置一台洗瓶机。准备可以购置一台洗瓶机。准备12个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。很高的玻璃器皿。还应配置落水架、干燥箱、超声波清洗器、纯水制备等。还应配置落水架、干燥箱、超声波清洗器、纯水制备等。地面应耐湿并排水良好。地面应耐湿并排水良好。超超声声波波清清洗洗机机电电热热干干燥燥箱箱纯纯水水仪仪洗洗瓶瓶机机 主要用于有关培养用液体、培养基母液和培养基的配制等。主要用于有关培养用液体、培养基母液和培养基的配制等。面积面积60 m2左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、实验台、药品柜、左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、实验台、药品柜、器械柜、天
6、平、微波炉、器械柜、天平、微波炉、pH计、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、培养基计、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、培养基分装器、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管（器）、分装器、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管（器）、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积180200 L为宜，用于储为宜，用于储存培养基母液、激素、维生素等贵重药品、彩色胶卷及保存植物材料。存培养基母液、激素、维生素等贵重药品、彩色胶卷及保存植物材料。天平应有不同感量。天平应有不同感量。1.2 制备室制备室pH计计天平天平移液器移液器 用于培养细胞所用器械、培养基的消毒与
7、灭菌。用于培养细胞所用器械、培养基的消毒与灭菌。配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干燥箱、配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干燥箱、消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。卧式灭菌锅。如果没有条件的话，可以将上述工作间合
8、并成一个准备间，要求设如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。防滑。1.3 消毒间消毒间 无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证
9、无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装台、鞋帽架、柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台、紫外灯、酒精灯、解剖镜、各种接种器械室内应配有超净工作台、紫外灯、酒精灯、解剖镜、各种接种器械等。等。1.4 无菌操作室无菌操作室超净工作台超净工作台离心机离心机 为了控制培养室的为了控制培养室的温度温度和和光照光照，培养室的房
10、间不要窗户，但应当，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，留一个通气窗，并安上排气扇。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室内温度由空调控制，光照培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室内温度由空调控制，光照时间及其强度由日光灯和自动定时开关控制。时间及其强度由日光灯和自动定时开关控制。培养室应配有若干培养架，上面固定日光灯、转床、摇床、光照培养室应配有若干培养架，上面固定日光灯、转床、摇床、光照
11、培养箱、生化培养箱、自动控时器等。培养箱、生化培养箱、自动控时器等。1.5 培养室培养室2、辅助实验室、辅助实验室 2.1 鉴定室鉴定室l细细胞学胞学鉴鉴定室定室 其功能是其功能是对对培养材料培养材料进进行行细细胞学胞学鉴鉴定和研究。要求清定和研究。要求清洁洁、明亮、明亮、干燥，使各种光学干燥，使各种光学仪仪器不受潮湿和灰器不受潮湿和灰尘污尘污染。染。应应配置各种配置各种显显微微镜镜、照相系、照相系统统等等l生化分析室生化分析室 在以培养在以培养细细胞胞产产物物为为主要目的主要目的实验实验室中，室中，应应建立相建立相应应的生化分的生化分析析实验实验室，以便于室，以便于对对培养物的有效成分随培养
12、物的有效成分随时进时进行取行取样检查样检查。离心机、离心机、酶酶联联免疫免疫检测仪检测仪、天平、天平、PCR仪仪等等PCR酶标仪酶标仪显微镜显微镜为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。2.2 温室温室1.2 常用仪器与设备常用仪器与设备n基本设备：水纯化装置、基本设备：水纯化装置、冰箱、天平、酸度计、电炉、培养基分冰箱、天平、酸度计、电炉、培养基分装器、搅拌器、离心机及离心管、移液器（管）、吸管等。装器、搅拌器、离心机及离心管、移液器（管）、吸管等。n灭菌设备：灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、电热干燥箱、过滤除菌装置、喷雾蒸汽压力灭菌锅、电热干燥箱、过滤除菌装置、喷
13、雾消毒器、紫外灯。消毒器、紫外灯。n无菌操作设备：无菌操作设备：超净工作台超净工作台n光温控制设备：光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。时间程序控制器、空调及温度感应器。n细胞培养设备：细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。摇床、生物反应器等。n细胞学鉴定设备：细胞学鉴定设备：光学显微镜、实体显微镜、倒置显微镜等。光学显微镜、实体显微镜、倒置显微镜等。n除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。分析设备等。n培养器皿及实验
14、用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金属材质用具培养器皿及实验用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金属材质用具超超净净工工作作台台p基本原理：将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，基本原理：将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的、均匀再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的、均匀的断面风速通过无菌区，形成无尘无菌的高洁净度工作环境。的断面风速通过无菌区，形成无尘无菌的高洁净度工作环境。p侧流式（或垂直式）超净工作台：净化后的空气气流由左侧（或侧流式（或垂直式）超净工作台：净化后的空气气流由左侧（或右侧）通过工作台面流向对侧，也
15、有从上向下（或从下向上）流右侧）通过工作台面流向对侧，也有从上向下（或从下向上）流向对侧，形成气流屏障以保持工作区无菌；在净化气流和外边气向对侧，形成气流屏障以保持工作区无菌；在净化气流和外边气体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有发生污染的可能性发生污染的可能性p外流式（或水平层流式）超净工作台：使净化后的空气面向操作外流式（或水平层流式）超净工作台：使净化后的空气面向操作者流动，外方气流不致混入操作区；不能进行有害物质实验操作；者流动，外方气流不致混入操作区；不能进行有害物质实验操作；因多为开放式，没有防护挡板，操作
16、和拿取物品方便，但可能受因多为开放式，没有防护挡板，操作和拿取物品方便，但可能受外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。p用于用于细细胞培养中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒胞培养中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒p温度范温度范围围：50300p实验实验室常用：鼓室常用：鼓风风式式电热电热干燥箱干燥箱优优点：温度均匀、效果点：温度均匀、效果较较好；好；缺点：升温缺点：升温过过程程较较慢慢p注意事注意事项项：1、升温、升温时时不能先升温后鼓不能先升温后鼓风风，应应鼓鼓风风与升温同与升温同时时开始，至开始，至100时时停止鼓停止鼓风风2、消毒
17、后，不能立即打开箱、消毒后，不能立即打开箱门门以免以免骤骤冷而致玻璃器皿冷而致玻璃器皿损损坏，坏，应应等温等温度自然下降至度自然下降至100以下以下时时方可开方可开门门3、温度、温度过过高可致包裹玻璃器皿的高可致包裹玻璃器皿的纸纸或棉花或棉花烧烧焦，焦，烧烧焦碎屑影响焦碎屑影响细细胞胞的生的生长长电电热热干干燥燥箱箱水水纯纯化装置化装置 所有与培养所有与培养细细胞接触的液体均需用胞接触的液体均需用纯纯水配制；三次蒸水配制；三次蒸馏馏水水冰箱冰箱p储储存各种溶液和短期保存存各种溶液和短期保存组织标组织标本等；本等；p-20储储存需冷存需冷冻冻保持生物活性及保持生物活性及较长时较长时期存放的制期存
18、放的制剂剂，酶酶、血清、血清、抗生素、谷氨抗生素、谷氨酰酰胺等胺等p专专属属专专用，不存放用，不存放挥发挥发、易燃等、易燃等对细对细胞有害的物胞有害的物质质p保持清保持清洁洁压力蒸汽消毒器压力蒸汽消毒器p直接或间接与细胞接触的物品均须消毒灭菌处理直接或间接与细胞接触的物品均须消毒灭菌处理p内热源侵入式电加热压力蒸汽消毒器内热源侵入式电加热压力蒸汽消毒器p注意事项：严格按照操作说明执行注意事项：严格按照操作说明执行细胞计数板细胞计数板 也称血细胞计数板，进行培养细胞计数和活性细胞的观察也称血细胞计数板，进行培养细胞计数和活性细胞的观察电子细胞计数仪电子细胞计数仪 自动计数细胞悬液中的细胞数，尤其
19、适用于进行细胞生长曲自动计数细胞悬液中的细胞数，尤其适用于进行细胞生长曲线实验线实验过滤除菌装置过滤除菌装置p适用对象：含维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质的人工合成适用对象：含维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质的人工合成培养液、血清、胰蛋白酶等，高温或射线照射下易发生变性或失活培养液、血清、胰蛋白酶等，高温或射线照射下易发生变性或失活pZeiss滤滤器器金属，直径金属，直径142 mm和和293mm抽抽滤滤式（式（负压负压）：）：进进液口与一盛液瓶相液口与一盛液瓶相连连，缓缓慢使气体回流，在抽慢使气体回流，在抽滤滤瓶与真空抽气瓶与真空抽气泵泵之之间连间连一个一个负压负压瓶瓶加加压压式（正
20、式（正压压）：）：连连一正一正压泵压泵或蠕或蠕动泵动泵的密的密闭滤闭滤器，通器，通N2气体以造气体以造成容器内成容器内压压力，使力，使滤滤液液滤过滤过，调调整整N2压压力不超力不超过过19.6 kPa；压压力比力比较较恒定，恒定，滤过滤过效果好，蛋白效果好，蛋白质质不易不易变变性性p玻璃漏斗式滤器玻璃漏斗式滤器滤滤板与玻璃漏斗板与玻璃漏斗为为一体，根据一体，根据滤滤板的孔径可分板的孔径可分为为G1G6几种几种规规格，格，仅仅G5和和G6能达到能达到滤过滤过除菌的要求除菌的要求适用于各种培养液的适用于各种培养液的过滤过滤除菌，不宜除菌，不宜过滤过滤血清等粘稠液体；血清等粘稠液体；仅仅抽抽滤滤式，
21、用后清洗麻式，用后清洗麻烦烦p微孔微孔滤滤膜膜滤滤器器换换膜式膜式滤滤器和一次性器和一次性滤滤器器微孔微孔滤滤膜，孔径膜，孔径0.1m（可去除支原体）、（可去除支原体）、0.22 m（除菌效果（除菌效果较较保保险险）、）、0.45 m和和0.8 m离心机离心机p分离分离细细胞、胞、调调整整细细胞胞浓浓度、洗度、洗涤涤、收集、收集细细胞等胞等p低速；高速（低速；高速（DNA、RNA提取）、大容量、控温离心机提取）、大容量、控温离心机（神（神经细经细胞）胞）移液管：移液管：玻璃、塑料材玻璃、塑料材质质；1、2、5、10、20ml吸管吸管移液器：移液器：微量移液器、多通道可微量移液器、多通道可调调式
22、微量移液器、式微量移液器、电动电动移移液器液器离心管：离心管：塑料和玻璃材塑料和玻璃材质质天平天平 动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：p培养箱：恒温培养箱、培养箱：恒温培养箱、CO2培养箱（适合开放式或半开放式细胞培养箱（适合开放式或半开放式细胞培养，恒定提供定量培养，恒定提供定量CO2，通常使用条件为，通常使用条件为37、5%CO2）p显微操作仪：细胞核移植、染色体操作、显微注射、胚胎切割等显微操作仪：细胞核移植、染色体操作、显微注射、胚胎切割等p细胞融合仪：细胞融合细胞融合仪：细胞融合p细胞冷冻储存器：程序化冷冻仪、液氮容器（液氮温度低达细胞冷冻储存器
23、：程序化冷冻仪、液氮容器（液氮温度低达-196，防止冻伤；液氮挥发，定期观察，补充），防止冻伤；液氮挥发，定期观察，补充）p培养用器皿培养用器皿p手术器械：解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件手术器械：解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件p培养用器皿培养用器皿透明度好、无毒的中性硬质玻璃：多数细胞可生长，易于清洗、透明度好、无毒的中性硬质玻璃：多数细胞可生长，易于清洗、消毒，可反复使用，透明便于观察；易碎、清洗时费人力消毒，可反复使用，透明便于观察；易碎、清洗时费人力无毒、透明光滑的特制塑料：一次性使用，方便；费用较高无毒、透明光滑的特制塑料：一次性使用，方便；费用较高1）培养皿：玻璃或塑料制
24、成，盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、）培养皿：玻璃或塑料制成，盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验，常用规集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验，常用规格格3.5 cm、6 cm、9 cm、10 cm等等2）培养瓶：培养细胞种类要求不同，形态各异；细胞传代：瓶壁厚）培养瓶：培养细胞种类要求不同，形态各异；细胞传代：瓶壁厚薄均匀，瓶口大小一致，口径一般不小于薄均匀，瓶口大小一致，口径一般不小于1 cm；规格有；规格有10 ml、25 ml、50 ml、100 ml、200 ml等；外周血培养常用等；外周血培养常用10 ml普通原瓶普通原瓶
25、3）培养板：）培养板：细细胞培养、胞培养、细细胞克隆及各种胞克隆及各种检测检测；常用；常用规规格有格有4孔、孔、6孔、孔、12孔、孔、24孔、孔、96孔等孔等4）旋）旋转转培养器：用于某些特殊培养器：用于某些特殊细细胞或需要收胞或需要收获获大量大量细细胞的培养胞的培养p手手术术器械：解剖、取材、剪切器械：解剖、取材、剪切组织组织及操作及操作时时持取物件；手持取物件；手术术刀柄、刀柄、手手术术剪、剪、镊镊子、止血子、止血钳钳、持、持针针器；各种器械至少配器；各种器械至少配备备两套，使用后两套，使用后及及时时清洗，做防清洗，做防锈处锈处理；高理；高压压蒸汽消毒或蒸汽消毒或75%酒精浸泡消毒酒精浸泡
26、消毒植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：p光照培养箱：植物材料少量培养；光照、暗箱；光照培养箱：植物材料少量培养；光照、暗箱；调调湿与不可湿与不可调调湿；湿；人工气候箱（全自人工气候箱（全自动调动调温、温、调调湿、控光）湿、控光）p人工气候室：模人工气候室：模拟拟自然界的各种气象条件，精确控制室内的温度、自然界的各种气象条件，精确控制室内的温度、光照、湿度、光照、湿度、CO2等，在种子等，在种子发发芽、植物培养、芽、植物培养、组组培、植保等培、植保等领领域域应应用广泛用广泛p摇摇床：床：细细胞胞悬悬浮培养，常用振浮培养，常用振荡荡速度速度100 r/minp
27、培养瓶：玻璃三角瓶、试管、光口玻璃瓶；硼硅酸盐玻璃器皿培养瓶：玻璃三角瓶、试管、光口玻璃瓶；硼硅酸盐玻璃器皿2.1 动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：培养箱（恒温培养箱和培养箱（恒温培养箱和CO2培养箱）、显微操作仪、培养箱）、显微操作仪、细胞融合仪、细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮细胞融合仪、细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮容器）、培养用器皿、手术器械容器）、培养用器皿、手术器械2.2 植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：光照培养箱、人工气候箱、摇床和培养瓶光照培养箱、人工气候箱、摇床和培养瓶第第2章章 清洗与消毒
28、清洗与消毒 离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，微生物、离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，微生物、细胞碎片以及非营养性化学成分都可能影响细胞的生长，细胞碎片以及非营养性化学成分都可能影响细胞的生长，对培养器皿清洗与消毒的要求极为苛刻。因此，清洗和消对培养器皿清洗与消毒的要求极为苛刻。因此，清洗和消毒是否彻底直接关系到细胞培养的成败。掌握清洗、消毒毒是否彻底直接关系到细胞培养的成败。掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是细胞培养工作的基本功。知识，学会清洗、消毒方法是细胞培养工作的基本功。洗洗涤涤液的配制液的配制一、清洗一、清洗p玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗玻璃器皿：浸泡、刷洗、
29、浸酸和冲洗清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质u新新购买购买的玻璃的玻璃仪仪器表面常附着有游离的碱性物器表面常附着有游离的碱性物质质，可先用，可先用0.5的去的去污剂污剂洗刷，再用自来水洗洗刷，再用自来水洗净净，然后浸泡在，然后浸泡在12盐盐酸溶液中酸溶液中过过夜夜（不可少于（不可少于4 h），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100120烘箱内烘干烘箱内烘干备备用。用。u使用过玻璃器皿：先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去使用过玻璃器皿：先用自来水洗刷至无污
30、物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。重新清洗。p胶塞清洗胶塞清洗 新购置的瓶塞带有滑石粉及杂质。新购置的瓶塞带有滑石粉
31、及杂质。方法：先用自来水冲洗；每次用后立即置入水中浸泡，用方法：先用自来水冲洗；每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH（洗衣粉）煮沸（洗衣粉）煮沸1020min；自来水冲洗后，；自来水冲洗后，1%稀盐酸浸泡稀盐酸浸泡30min，或蒸馏水冲洗后再煮沸或蒸馏水冲洗后再煮沸1020min，晾干备用。，晾干备用。聚乙聚乙烯烯、聚丙、聚丙烯烯等制成的塑料器皿，无毒、特殊包装等制成的塑料器皿，无毒、特殊包装优优点在生点在生物学物学实验实验中中应应用越来越广泛。第一次使用塑料器皿用越来越广泛。第一次使用塑料器皿时时，可先用，可先用8mol/L尿素（用尿素（用浓盐浓盐酸酸调调pH=1）清洗，接着依次用无离子
32、水、）清洗，接着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，然后用和无离子水清洗，然后用10-3 mol/L EDTA 除去金属离子的除去金属离子的污污染，染，最后用无离子水最后用无离子水彻彻底清洗，以后每次使用底清洗，以后每次使用时时，可只用，可只用0.5的去的去污剂污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗清洗，然后用自来水和无离子水洗净净即可。即可。使用使用过过程中，注意：防止划痕；用后及程中，注意：防止划痕；用后及时时浸泡浸泡p塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时
33、，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。p 金属用品洗涤金属用品洗涤p除菌过滤器洗涤除菌过滤器洗涤 用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。洗，晾干备用。p包装包装 便于消毒、储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染便于消毒、储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染 灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，首先应建首先应建立有菌和无菌的概念立有菌和无菌的概念有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植有菌的范畴：凡是暴露在空气中
34、的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台台面，未处理的工具和手等。物的表面、超净工作台台面，未处理的工具和手等。无菌的范畴：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）无菌的范畴：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；火烤后的物体；物理或化学处理；火烤后的物体；健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）二、消毒二、消毒消毒方法消毒方法p物理灭菌法：紫外线、电离辐射、湿热、干热、过滤等物理灭菌法：紫外线、电离辐射、湿热、干热、过
35、滤等p化学消毒法：使用灭菌剂或抗生素，如酒精、次氯酸钠、升汞、化学消毒法：使用灭菌剂或抗生素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等1、紫外紫外线线消毒消毒 适用于适用于实验实验室空气、操作台面和一些不能用于湿室空气、操作台面和一些不能用于湿热热、干、干热灭热灭菌的菌的培养器皿的消毒，如塑料培养皿和培养板培养器皿的消毒，如塑料培养皿和培养板破坏微生物的核酸和蛋白破坏微生物的核酸和蛋白质质使其失活；臭氧使其失活；臭氧杀杀死微生物死微生物主要是利用紫外灯主要是利用紫外灯进进行照射，培养室灯距地面不超行照射，培养室灯距地面不超过过2.5m，离
36、工，离工作台面不超作台面不超过过1.5m，物品不互相遮，物品不互相遮挡挡。灭灭菌菌时间时间2030min。注意：关灯注意：关灯5 min后再后再进进入。超入。超净净工作台关灯后要打开工作台关灯后要打开风风机。机。2、电电离离辐辐射消毒射消毒 使用放射性核素产生的使用放射性核素产生的X线和加速器等发出的辐射进行灭菌消毒线和加速器等发出的辐射进行灭菌消毒适用于消毒量大和不适于做高压或滤过等培养用品，如培养瓶、培适用于消毒量大和不适于做高压或滤过等培养用品，如培养瓶、培养皿、培养板、注射器、移液器枪头、离心管等养皿、培养板、注射器、移液器枪头、离心管等优点：灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装物品进
37、行灭菌优点：灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装物品进行灭菌缺点：诱变作用很强，不适合消毒活的生物材料缺点：诱变作用很强，不适合消毒活的生物材料3、湿湿热热消毒消毒即高即高压压蒸汽消毒，使用最广泛、效果最好的消毒方法蒸汽消毒，使用最广泛、效果最好的消毒方法常用物品消毒常用物品消毒压压力及力及时间时间：培养液和橡胶制品：培养液和橡胶制品115、10min；布；布类类、玻璃制品及金属器械、玻璃制品及金属器械为为121.3、20min。4、干干热热消毒法消毒法电热电热烤箱温度至烤箱温度至160以上，保持以上，保持90120min，杀杀死死细细菌和芽菌和芽孢孢适用于玻璃器皿消毒适用于玻璃器皿消毒消毒完
38、消毒完毕毕后不可后不可马马上将烤箱上将烤箱门门打开打开优优点：消毒后的器皿干燥、易点：消毒后的器皿干燥、易储储存存缺点：缺点：热传导热传导慢；慢；橡胶、塑料制品不能使用此法橡胶、塑料制品不能使用此法灼灼烧烧：酒精灯火焰：酒精灯火焰对对金属器具及瓶口灼金属器具及瓶口灼烧烧，如，如接种环、涂布棒接种环、涂布棒5、过滤过滤除菌除菌将液体或气体用微孔将液体或气体用微孔滤滤膜膜过滤过滤，使大于孔径的，使大于孔径的细细菌等微生物菌等微生物颗颗粒阻留在粒阻留在滤滤膜上达到除菌目的膜上达到除菌目的适用于遇适用于遇热热易易发发生生变变性而失效的性而失效的试剂试剂或培养用液，抗生素、蛋或培养用液，抗生素、蛋白白质
39、质、维维生素等生素等正正压过滤较负压过滤压过滤较负压过滤具流速高、具流速高、过滤过滤快，不易快，不易污污染，避免蛋白染，避免蛋白质产质产生气泡等生气泡等6、化学消毒法化学消毒法 适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)消毒时间消毒时间(min)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-750.13好好易易新洁尔灭新洁尔灭1020530好好易易氯化汞氯化汞0.11215最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢1012515较好较好最易最易抗菌素抗菌素450mg/l3060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/钠钠9 1053
40、0好好易易 几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较（1）实验器皿、操作表面、皮肤一般用）实验器皿、操作表面、皮肤一般用7075%酒精；酒精；（2）升汞为剧毒药品，使用时注意别溅到皮肤上，使用后要进行处）升汞为剧毒药品，使用时注意别溅到皮肤上，使用后要进行处理，不能直接导入下水道。理，不能直接导入下水道。升汞处理方法：升汞处理方法：升汞升汞Na2S絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）FeSO4（中和过多的（中和过多的Na2S）注注 意意 方法方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。：甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲甲醛醛的用量通常按的用量通常按26 ml/m3计计算，高算，高锰
41、锰酸酸钾钾的用量是甲的用量是甲醛醛的的1/2。室内准。室内准备备妥当后，把高妥当后，把高锰锰酸酸钾钾放在瓷碗或放在瓷碗或烧烧杯内（最好在碗或杯下面杯内（最好在碗或杯下面铺铺一一张报纸张报纸，以利，以利清洗），然后将甲清洗），然后将甲醛醛也倒入碗或杯内，立即出屋关也倒入碗或杯内，立即出屋关门门。几秒。几秒钟钟后，甲后，甲醛醛溶液即溶液即沸沸腾挥发腾挥发。高。高锰锰酸酸钾钾是一种氧化是一种氧化剂剂，当它与一部分甲，当它与一部分甲醛醛作用作用时时，由氧化反，由氧化反应产应产生的生的热热可使其余的甲可使其余的甲醛挥发为醛挥发为气体。气体。甲甲醛醛熏蒸接种室熏蒸接种室应应至少在使用前至少在使用前24 h
42、进进行，熏蒸后密行，熏蒸后密闭闭保持保持4 h以上再以上再进进入入室内工作。甲室内工作。甲醛对醛对人的眼、鼻有人的眼、鼻有强强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进进行中行中和。取与甲和。取与甲醛醛等量的氨水，倒在另一个等量的氨水，倒在另一个烧烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛醛和和氨水氨水发发生中和反生中和反应应，以消除甲，以消除甲醛醛味，减少味，减少对对人体的刺激作用。使用氨水人体的刺激作用。使用氨水应应在工在工作前作前2 h进进行。行。对对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热热熏蒸。熏蒸。长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸 录像录像1、2 作业与思考作业与思考：课本P21 2、5