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1、外植体残存菌的危害与预防 先看一道试题： 植物组织培养过程中无菌操作很重要，某植物组织培养实验室培养的菊花愈伤组织被真菌严重污染，为查找污染原因设计了4个实验，实验遵循单一变量原则，得到下列实验结果，据此可得出的初步结论是()A.提高培养温度能解决污染问题B.调整培养基pH能解决污染问题C.延长培养基灭菌时间能解决污染问题D.污染主要来自组织培养的离体组织解析:培养基灭菌的时间、培养基pH以及培养温度发生变化时，污染率没有太大变化，但随着离体组织消毒时间的增加，污染率大幅度下降，说明污染的原因是组织培养的离体组织消毒不充分，A、B、C错误，D正确。故答案为D。 植物组织培养技术是解决农作物脱毒
2、复壮和快繁苗生产最主要的技术，昨天分享了脱毒技术，今天分享植物组织培养中的内生菌问题。在组织培养过程中，由于真菌、细菌等微生物的浸染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。在组织培养中污染是经常发生的，造成污染的原因也很多，主要有：培养基及各种使用器具消毒不彻底；外植体灭菌时不彻底，有菌残存在细胞中或细胞间；操作时人为因素带入；超净工作区域污染等等。其中，外植体灭菌时不彻底，有菌残存在细胞中或细胞间就是属于内生菌问题。问题：下面谈一谈植物组织培养中的内生细菌污染问题，以及内生细菌污染的预防措施。植物组织培养的内生细菌植物组织培养过程中的外界环境即使保持了无菌状态，但是
3、植物的组织或细胞间普遍存在着细菌，我们叫它内生细菌，这些内生细菌在培养过程中会对植物的生长造成一定的威胁，形成了内生细菌污染问题。植物内生细菌是生活于健康植物各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，由于内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，会随着外植体带入培养过程，在组培过程中不断出现明显的或不明显的细菌菌落，在部分植物组培时会造成培养基大面积污染，导致培养失败。1.内生细菌的症状及其危害内生菌可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污
4、染要长，接触性的细菌一般在24天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一，以后会不断地出现明显或不明显的细菌菌落，这种情况就有可能是由内生细菌引起的污染（如图）。内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率的降低，培养物生长减缓，玻璃苗增加等。在后期导致试管苗移栽困难和死亡，有时污染也会引起培养物的遗传变异。植物病理学有研究显示，威胁最大的还是无症状内生细菌，他们在植物生长过程中毫无表现，但是当植物生长环境恶劣，植物整体免疫机能降低时内生细菌就会发作，威胁植物的生长，特别是在农作物等具有经济价值的组织培养时，造成难以估量的经济损失。2.内生细菌污染的预防措施（1）抗生素的使用
5、问题在培养基中加入抗生素类药品来有效控制这类污染。但应注意抗生素对某些种类的植物生长有抑制作用，至于植物该使用哪一类抗生素，用多大浓度才适宜，要在实践中去摸索。尤其是有些抗生素还对植物的器官再生过程有一定的抑制作用。例如，彩色马蹄莲在组织培养时，培养基中添加了不同种类不同浓度的抗生素，发现50mg/L硫酸链霉素抑菌效果最好。芦笋组培苗继代时，采用四种抗生素处理来防治细菌污染，多种抗生素都能抑制细菌的污染，其中以卡那霉素抑制效果最好。总之，抗生素的使用还是有诸多限制的，有些抗生素互相抑制，有些抗生素还会抵制酸性环境或者碱性环境，甚至长时间使用抗生素某些内生细菌还会获得对某些抗生素的抗性，抗生素的
6、使用还是非常复杂的一件事情。（2）材料的预处理以新生的嫩枝作为外植体，可以降低污染，可以采用暗培养促进生枝。也可以使用温室或人工气候室内的植株接种材料，因为其表面内源细菌少而降低污染。还可以在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，也可以减少污染。对一些材料的提前处理，如一些物理方法的使用还是值得提倡的，比如真空减压灭菌（抽去植物组织的气体，使消毒剂容易进入植物组织，增强杀菌效果）、磁力搅拌、超声波振动、多次消毒灭菌、使用混合消毒液和灼烧的方法。（3）调节培养基的pHpH值对细菌和真菌细胞内酶的活力、细胞膜的通透性、细胞内外物质的运输和细胞呼吸等均有很大影响。大多数细
7、菌在pH小于4.5的环境下不能生长。因此，可以通过适当调节培养基的pH来避免大量的细菌污染产生。虽然这些方法可以有效减少内生细菌的污染，但是并不能彻底灭杀，所以最行之有效的方法，还是在无污染的外植体上切取需要的组织进行培养繁殖。典型试题解析试题1： 试题2：花药离体培养是重要的育种手段。下图是某二倍体植物花药育种过程的示意图，下列叙述正确的是()A.为了防止微生物污染，过程所用的花药需在75%酒精中浸泡30 minB.过程的培养基中需添加较高浓度的细胞分裂素类物质以利于根的分化C.过程逐步分化的植株中可筛选获得纯合的二倍体D.过程应将炼苗后的植株移栽到含有蔗糖和多种植物激素的基质上解析：植物组
8、织培养过程应该在无菌的条件下进行，因此过程所用的花药需在75%酒精中浸泡30s，以防止杂菌污染，A错误；过程的培养基中需添加比值适中的细胞分裂素和生长素，以利于形成愈伤组织，B错误；过程得到的植株是经过花药离体培养和秋水仙素处理的，因此可筛选获得纯合的二倍体，C正确；过程获得的植株可以进行光合作用，因此培养基中不需要加入蔗糖，D错误。故答案为C。 下列关于植物组织培养的叙述，正确的是A.需要对外植体进行严格的灭菌处理，以防止杂菌污染B.在培养过程中需要给予适宜的光照，以诱导脱分化过程C.外植体只需培养成愈伤组织即可制备人工种子D.培养基中所添加的激素种类和含量对培养过程起重要的调节作用【答案】D【解析】外植体一般只消毒处理，不灭菌处理，保持外植体的活性，A错误；愈伤组织的诱导往往需要暗培养，再分化一定要有光照，B错误；若制备人工种子，外植体需培养成胚状体，再用人工种皮包裹，C错误；养基中所添加的激素种类和含量对培养过程起重要的调节作用， D正确。学科网（北京）股份有限公司