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1、如果试图提升柱效和柱容量，可以减小介质粒径，但这会大大增加柱子压降，增加层析时间；如果试图加快层析时间，由于没有足够时间扩散，则会牺牲柱容量和分辨率。第1页/共132页从介质颗粒结构的角度来说，是否可有更好的解决办法！？第2页/共132页灌注层析技术Perfusion Chromatography第3页/共132页1989年，美国的Regnier和Afeyan等人率先发明了具有贯穿孔的分离载体（FlowthroughParticle）POROS，并申请了专利，并将这一技术命名为灌注层析技术（PerfusionChromatography）第4页/共132页Perfusion Chromatog
2、raphy灌注层析传统层析第5页/共132页在灌注层析中，固定相粒子的特殊设计使分子更易通过直通孔和扩散孔进入粒子内部，直通孔直径约为600800nm，扩散孔直径为80150nm，结合了对流和扩散双重作用，加速了分子传质。第6页/共132页所以，灌注层析表现出以下优点：1、分离速度比传统层析快10100倍而分辨率不变。2、分辨率和吸附量不再依赖于流速。3、减少了分子在层析柱中停留时间，减少了目标分子降解，变性等作用，提高了分子活性。4、层析放大的成本降低。第7页/共132页灌注层析在流速加快的情况下不影响柱容量和分辨率，不会增加反压，为快速纯化生物大分子提供了基础。灌注层析技术只是增强了传质的
3、动力学过程而不改变层析的分离原理，因此可以用于除凝胶色谱外的所有层析技术中。第8页/共132页灌注层析的介质POROS是在苯乙烯-二乙烯苯的交联共聚物基础上构成的，具有很高的机械和化学稳定性。也可以使用铝、硅或羟基磷灰石等。通过对惰性骨架的处理，可以使介质活化产生不同的功能基团，用于不同的层析技术，如离子交换，疏水层析，亲和层析等第9页/共132页色谱的效能问题2传统填充色谱柱内由于存在涡流扩散和传质阻力等问题，使各个组分分子走过路程长短不一，结果峰形变宽，分辨率降低，理论塔板数减少。那么，能不能使溶质分子走的路径不再弯曲？第10页/共132页毛细管色谱柱毛细管柱：可分为壁涂毛细管柱和填充毛细
4、管柱两种。空心毛细管柱是将固定液直接涂在内径只有0.10.5mm的玻璃或金属毛细管的内壁上；填充毛细管柱是将某些多孔性固体颗粒装入厚壁玻管中，然后加热拉制成毛细管，一般内径为0.250.5mm。第11页/共132页毛细管柱的特点1.传质阻力小，可用长柱，总柱效分离效能高，理论塔板数可高达几十万2.分析速度快。3.样品用量少，柱容量也小。第12页/共132页毛细管柱的选择1.内径越小，效率越高，但柱容量也越低。2.柱长越长，分离度越高3.液膜厚度越大，柱容量越大，组分出柱越晚，同时由于增加了传质阻力，柱效可能会下降。4.固定相类型，在分离度很高的情况下，选择性不再是唯一标准，其他稳定性，兼容性，
5、使用温度等都需要考虑。第13页/共132页一、固定液非极性、中极性、极性。二、柱内径（mm）0.20.25柱效高、负荷量低、流失小0.30.35负荷量大于毛细口径柱60%，柱效稍低0.530.6大口径毛细柱，负荷量近似填充柱，总柱效超过填充柱。第14页/共132页三、柱长（m）短柱1015米分离少于10个组份的样品中长柱2030米分离1015个组份的样品长柱50米以上分离50个组份以上的样品四、液膜厚度（m）薄液膜0.10.2m低负荷量、高沸点化合物标准液膜0.250.33m一般标准毛细柱分析厚液膜0.51m负荷量较大，低沸点样品特厚液膜15m取代填充柱，分析沸点200以下复杂样品第15页/共
6、132页第16页/共132页气相色谱气相色谱法系采用气体为流动相（载气）流经装有固定相的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，记录并形成色谱信号。第17页/共132页气相色谱采用气体作为流动相，由于物质在气相中的扩散速比在液相中快得多，气体又比液体的渗透性强，因而相比液相色谱，气相色谱柱阻力小，传质速度快，可以迅速达到分配平衡，分离效率高。第18页/共132页气相色谱分析流程第19页/共132页气相色谱仪组成1.载气系统：一个让载气连续运行、管路密闭的气路系统，通过该系统，可以获得纯净的、流速稳定的载气。它的气密性、载气流速的稳定性
7、以及测量流量的准确性，对色谱结果均有很大的影响，因此必须注意控制。第20页/共132页2.进样系统：进样系统包括进样器和气化室两部分。进样系统的作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱之前瞬间气化，然后快速定量地转入到色谱柱中。进样的多少，进样时间的长短，试样的气化速度等都会影响色谱的分离效果和分析结果的准确性和重现性。第21页/共132页分流法：毛细管柱进样量极小，要引进微量样品，常采用分流法进样。即在气化室出口分两路，大部分放空，小部分进柱子，这两部分比例叫分流比。第22页/共132页3.色谱柱：色谱柱主要有两类：填充柱和毛细管柱。a.填充柱:由不锈钢或玻璃材料制成，内装固定相，一般内径为24
8、mm，长13m。填充柱的形状有U型和螺旋型二种。b.毛细管柱:空心毛细管柱材质为玻璃或石英。内径一般为0.20.5mm，呈螺旋型。第23页/共132页在以氮为载气时，毛细管柱的线速可达16厘米/秒，而填充柱在4厘米/秒，毛细管柱可采用很高的载气线速来缩短保留时间，故毛细管柱上可实现快速分析。第24页/共132页4.尾吹：毛细管柱内流动相流量太小，不能满足检测器的最佳操作条件，或是组分会因柱后死体积突然增加导致膨胀流速减缓，而发生严重的纵向扩散，从而导致峰形展宽，影响分离。增加尾吹气可改善这一问题。第25页/共132页尾吹气：是从色谱柱出口直接进入检测器的气体，也叫补充气或辅助气，填充柱不用尾吹
9、气，而毛细管柱大都采用尾吹气。第26页/共132页5.检测系统：色谱柱内径细，只能分析小量样品，要求高灵敏度检测器。快速分析时因峰宽只有几秒或少于1秒，要求检测器、记录器响应时间快。目前有多种检测器可与气相色谱联用，其中常用的检测器是：氢火焰离子化检测器（FID）热导检测器（TCD)氮磷检测器（NPD）火焰光度检测器（FPD）电子捕获检测器（ECD)等类型。第27页/共132页气相色谱的应用气相色谱分析可以应用于分析气体试样，也可分析易挥发或可转化为易挥发的液体和固体，可分析有机物，也可分析部分无机物。一般地说，只要沸点在500以下，热稳定良好，相对分子质量在400以下的物质，原则上都可采用气
10、相色谱法。对于难挥发和热不稳定的物质，气相色谱法是不适用的。第28页/共132页对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。第29页/共132页高高效液相色谱法效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，已成为应用极为广泛的分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度
11、快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。第30页/共132页高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。在分析速度上可比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cmmin-1第31页/共132页固定相但体和粒度的区别操作压力的区别色谱柱长，柱内径，柱效的区别样品用量、分析时间的区别第32页/共132页气相色谱与HPLCHPLC的比较1.气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不
12、同极性的液体，并参与组分的分离。第33页/共132页2.气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则通常在室温条件下工作。3.分析对象的区别4.柱长，柱形的区别第34页/共132页第35页/共132页HPLC的组成1.高压输液系统：由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。（恒压与恒流）第36页/共132页脉动第37页/共132页2.进样系统：高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱
13、外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积等。进样系统是引起展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。第38页/共132页第39页/共132页3.3.色谱柱：同样，可以分为填充柱和毛细管柱，但通常较气相色谱柱短，在柱前还可备一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱可以完全一样，这样可使淋洗溶剂经过前置柱而为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再与其中固定相作用，保证分离性能不受影响。第40页/共132页多数用于HPLC的色谱柱是用一节内壁经高度抛光处理的直不锈钢管，用收缩接头将其与HPLC仪器连接。不锈钢可用于所有有机溶剂与大多数水性缓冲液。但含氯的流动相
14、可能会缓慢地卤素腐蚀不锈钢材质（尤其在低pH时），所以使用该流动相时应小心。第41页/共132页色谱柱的保存：避免将柱子泡在水中保存，避免在缓冲液中保存（尤其那些含高浓度水和醇类的）。应加入有机溶剂和叠氮钠，将色谱柱贮存于100%有机溶剂（如乙腈）中是保存键合相柱性能与寿命的最好方法之一。避免柱子干涸，应将色谱柱两头塞紧，以防填充床干涸。第42页/共132页4.检测器。主要有紫外、荧光、电化学检测器，示差折光，电导检测器等第43页/共132页分子印迹MolecularImprintingTechnology第44页/共132页概述抗原与抗体，酶与底物的特异性识别对于抗原抗体的模仿和“塑料抗体”
15、的产生。第45页/共132页分子印迹的基本过程第46页/共132页分子印迹聚合物制备过程 3、将模板分子从高聚物中解离出来。1、功能单体通过与模板分子相互作用聚集在模板分子周围形成某种可逆的复合物。2、功能单体与过量交联剂在致孔剂存在下发生共聚生成高聚物。第47页/共132页模板分子（印迹分子）根据所要识别分离的化合物的结构和性质，模板分子可以是低分子化合物、低聚物、金属离子或金属络合物，也可以是分子聚集体。应用较多的模板分子有糖类及其衍生物、氨基酸及其衍生物、药物、激素、杀虫剂,染料、酶或辅酶、核酸、肽等。第48页/共132页功能单体：具有可聚合的乙烯基和能与印迹分子相互作用的功能基团的物质
16、。第49页/共132页分子印迹的制备作用方式：共价键法（预组装法）功能单体与印迹分子以共价键形式结合，作用力强，结合解离速度慢。非共价键法（自组装法）作用力包括静电，氢键，疏水作用，范德华力等，是目前常用的方法。将共价与非共价作用相结合 通过共价作用合成MIPs，使用过程中以非共价方式进行，兼具两者的优点。第50页/共132页共价型印迹聚合物结合解离慢，反应条件苛刻，相应的功能单体也比较有限，常用的功能单体是含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚等。非共价型印迹聚合物功能单体通常具有一个碳碳双键和一个羧基，能与许多官能团发生较强的分子间作用，最常用的是甲基丙烯酸（MAA）第51页/共132页分子印迹聚合
17、物的特点1.预定性：人们可以根据不同的目的制备不同的MIP2.实用性：它与天然的识别系统如酶和底物,抗体和抗原相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高度稳定性和长的使用寿命，且制备简单。3.特异识别性：MIP是根据印迹分子定做的，它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子第52页/共132页影响分子印迹吸附的因素印迹分子的影响：分子结构中含有强极性基团和氢键等，由于氢键具有方向性和饱和性，作用力较强，因此能形成氢键的印迹分子往往能制备高选择性能的MIPs。第53页/共132页功能单体的影响：功能单体与印迹分子的结合是MIPs制备的关键，主要有三点要求：1、在合成时，功能单体与印记分子之间
18、的结合要尽可能的强，这样才能在聚合过程中把印迹分子牢牢固定住，使之按正确的空间位置排列。第54页/共132页2、生成聚合物后，印迹分子要能尽可能的与单体分子解离去除。3、功能单体能再次与目标物质分子良好结合，并且这一过程要尽可能的快速并且可逆性好。可见，对第一种要求，希望结合作用有高的活化能，而对后两种结合作用则要求较低的活化能。第55页/共132页在实际使用过程中，可以将不同类型的单体混用，使之具有不同的键合种类和数量，提高MIPs的选择性。第56页/共132页交联剂的选择：MIPs的选择性与交联剂的种类和用量有很大的关系，足够的交联剂的作用是具有一定的硬度，使空穴的形态稳定化，形成稳定的结
19、合位点。同时交联剂适当的柔性又使空穴具有良好的可近性。MIPs往往需要很高的交联度（7090%）第57页/共132页最常用的交联剂是二甲基丙烯酸二醇酯（EDMA），分子内含有2个乙烯基，可以在聚合反应中形成网状。近年来还有采用含3个或以上乙烯基的交联剂，能获得较高的容量，选择性和柱效率。印迹分子、功能单体与交联剂的参考比例为1：4：20第58页/共132页第59页/共132页MIPs不仅具有特定的选择性和高亲和性，而且还具有很好的物理化学稳定性，如能抵抗很强的机械作用力、能耐高温高压、能抵抗酸碱、高浓度的盐溶液及有机溶剂作用，使用寿命长，能多次重复使用而不损失分子记忆效应。是一种重要的手性色谱
20、固定相技术，在手性分子分离方面有着广阔的应用前景。第60页/共132页分子印迹固相萃取技术MIPs具有特异选择性的优点使之非常适合作为SPME的涂层材料，可将MIP的高选择性与SPME技术操作简便、易自动化的特点结合在一起，不仅SPME获得了更高的选择性，能够更高效地从复杂样品中分离富集目标分子，清除基体干扰，从而降低检出限，提高分析的精度和准确性。第61页/共132页分子印迹膜分离技术分子印迹膜（MIM）是一种结合了微孔筛分作用和分子印迹特异性吸附能力的膜技术。由于膜对目标分子的特异性吸附及由此而来的对扩散通道更高的接近能力，MIM能传输特定的底物分子，对MIM的研究是分子印迹技术领域的热点
21、。第62页/共132页MIPs作为选择性分离剂所存在的问题：1、制备MIPs需要大量纯净的印迹分子2、分离容量不足3、MIPs骨架的非特异性吸附4、亲和性仍然不及天然配体5、功能单体，交联剂和聚合方法仍然有限第63页/共132页6、多数MIPs的制备和使用都是在非极性溶液中进行，对水溶性分子的分离有局限性。7、由于目前MIP制备方法本身存在合成时须使用大量模板分子的问题，导致模板分子渗漏现象难以得到根本解决，限制了分子印迹技术在痕量分析中的实际应用。第64页/共132页生物大分子印迹面临的挑战生物大分子印迹机理对于蛋白质等生物大分子来说，其功能结构比较复杂。蛋白质的空间构型和侧链的氨基酸功能机
22、基团如丝氨酸的羟基，酪氨酸得苯酚环，赖氨酸的氨基，半胱氨酸的巯基都给MIPs技术带来了许多不可预测的因素。蛋白质的构型在聚合反应的条件和过程中可能发生改变，从而使获得的MIP与模板蛋白不匹配以至失去亲和作用。第65页/共132页蛋白质等大分子进行印迹的单体应该比小分子印迹聚合物的单体更为惰性，否则很容易造成非特异性吸附。寻找温和有效的洗脱方法也是目前该领域的一个亟待解决的问题，如果吸附的目标分子无法被洗脱并保持其生物活性，对于比较昂贵的蛋白质分子印迹技术的发展就会受到很大的限制。第66页/共132页分子印迹技术的其他应用酶催化，抗体模拟，生物传感器，缓释药物，地质测量，食品药物安全检测，环境监
23、控等第67页/共132页电泳分离技术第68页/共132页电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。正极负极带负电粒子带正电粒子第69页/共132页电泳的主要影响因素1、电泳介质的pH值：溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH值离pI越远，则颗粒净电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢。因此应选择合适的pH，使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开，为了使电泳过程溶液pH值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。第70页/共132页2、缓冲液的离子强度：离子强度影响颗粒的电动电势。溶液的离子强度越高，电动电势越小，则电
24、泳速度越慢，反之，则越快。离子强度过低，溶液的缓冲能力减弱，不易维持所需pH值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。第71页/共132页3、电渗现象液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。第72页/共132页 +-液相固相电渗流电渗示意图第73页/共132页4 4、电场强度：电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度对电泳速度起着决定性作用，
25、电场强度越高，电泳速度越快，但随着电压的增加，电流加大，产生热效应影响电泳。进行高压电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中降温。第74页/共132页5、温度的影响 电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置。第75页/共132页电泳的分类第76页/共132页按支持介质的不同，还可以分为惰性载体类和凝胶类电泳。惰性载体包括滤纸，醋酸纤维素薄膜和硅胶等。凝胶包括琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等第77页/共132页醋酸纤维素薄膜电泳第78页/共132页充分浸泡，没有气泡点样均匀勿点多膜分2面电压大了会烧第79页/共132页
26、特点：电泳后区带界限清晰；通电时间较短；它对各种蛋白质几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；灵敏度高，样品用量少。对染料也没有吸附。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果。第80页/共132页凝胶电泳较少对流，防止扩散，具有分子筛效应，设备简单，操作方便，具有很高的分辨率和选择性。是一种很常用的电泳分离技术。凝胶电泳的主要介质包括琼脂糖和聚丙烯酰胺。第81页/共132页琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中提取的胶状多糖，常态下为白色粉末，使用时按一定比例加入缓冲液，加热熔化成均匀液态胶体，倒入电泳槽冷凝后即可使用。使用十分简单，胶体具有分子筛效应，孔径可调，性质稳定，样品易于回收。常用于DNA，
27、RNA，以及一些蛋白质的分离分析，分辨率不及聚丙烯酰胺。第82页/共132页第83页/共132页第84页/共132页琼脂糖凝胶用于DNA电泳时，常用EB染色，EB是一种强致癌剂，使用时应特别小心。第85页/共132页质粒电泳开环线形超螺旋第86页/共132页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法PAGE应用广泛，可用于蛋白质、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等第87页/共132页常规聚丙烯酰胺凝胶电泳电荷因素分子大小分子形状电荷效应与分子筛
28、效应共同起作用电荷效应与分子筛效应共同起作用第88页/共132页聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；第89页/共132页(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率
29、。第90页/共132页丙烯酰胺凝胶聚合原理第91页/共132页第92页/共132页丙烯酰胺的聚合（1）AP-TEMED：化学聚合作用。加速剂TEMED的碱基可使催化剂过硫酸铵（简称AP）的水溶液产生出游离氧原子，然后激活单体，形成单体长链，在交联剂Bis作用下聚合成凝胶。（2）核黄素-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。第93页/共132页影响聚合反应的各种因素：催化剂的浓度：应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在3060min内较好，过量的催化剂和加速剂会引
30、起烧胶和蛋白质条带的畸变。pH：TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。第94页/共132页温度：聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。分子氧：分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。杂质：某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP。第95页/共132页聚丙烯酰胺凝胶的一些相关概念凝胶浓度：每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，用T%
31、表达；T%=(a+b)/ma：丙烯酰胺克数；b：N,N-甲叉双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）。第96页/共132页交联度凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示。C%=b/（a+b）凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，丙烯酰胺凝胶易呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。第97页/共132页凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶来测试
32、，而后确定适宜的凝胶浓度。第98页/共132页聚丙烯酰胺凝胶电泳的连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，可分为连续的和不连续的两类。前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。第99页/共132页不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳1.孔径的不连续性：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的
33、区带。第100页/共132页2.缓冲液离子成分的不连续性,（等速电泳）体系中含三种离子。走在最前面的称为快离子或前导离子。走在最后的称为慢离子或尾随离子。第101页/共132页快离子和慢离子间形成一个稳定的迁移界面，形成三种离子移动界面，蛋白质离子夹在中间，被浓缩成一薄层。第102页/共132页3.凝胶pH 的不连续性：浓缩胶和分离胶的pH不同，这是为了控制尾随离子的的解离度从而控制其迁移速率。浓缩胶中要控制尾随离子使其走得慢来形成离子界面，到了分离胶，则要使其走得快，消除离子界面的影响。第103页/共132页当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时，由于pH值和凝胶孔径突然改变
34、，慢离子的解离度增大，因而它的有效迁移率也增加，此时慢离子的有效迁移率超过了所有蛋白质的有效迁移率，从而赶上并超过所有蛋白质分子，这样，高电压梯度不存在了，浓缩效应被破坏，蛋白质样品是在一个均一的电压梯度和pH条件下通过分离胶。第104页/共132页第105页/共132页第106页/共132页SDS-PAGESDS-PAGE：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，加入的SDS和还原剂主要有2个作用，一是破坏蛋白质的高级结构，二是与蛋白结合屏蔽蛋白自身所带的电荷。其结果是这种蛋白在电泳中的迁移率只与蛋白质的分子量大小有关，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。第107页/共13
35、2页SDS-PAGE的主要影响因素SDS的浓度：P与SDS的质量比应为1：4或1：3缓冲液的离子强度需要较低的离子浓度，10100mmol/L二硫键的还原程度合适的凝胶浓度第108页/共132页注意两板之间要均匀夹紧，不要接触板内表面，胶配好后要尽快加入板中，特别是加入引发剂和加速剂后。板内不能留有气泡，上胶后要以蒸馏水密封。第109页/共132页配胶，注入，液封，聚合，上样，电泳，染色第110页/共132页等电聚焦电泳等电聚焦(isoelectro focusing)，缩写为IEF或EF，是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01p
36、H单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。第111页/共132页 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一定的pH环境中，蛋白质分子呈电中性，在电场中不会迁移。等电聚焦就是在电泳介质中放入两性载体电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pHpH梯度，在此体系中，不同的蛋白质移动到其相当的等电点位置上，就不再迁移，也就是说被聚焦于一个狭窄的区带中，也称为聚焦电泳。第112页/共132页高pH等电聚焦电泳进行过程中低pH（）（）高pH等电聚焦电泳结束后低pH（）（）第113页/共132页pH梯度的形成用多种两性电解质混合物建立稳定良好的pH梯度，载体两性电解
37、质是一些具有相近等电点的分子量为600900Da的多氨基多羟基两性化合物的混和物第114页/共132页理想的载体两性电解质应具备的特征：分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；化学性质稳定；各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力；在pI处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多；可溶性好；对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。第115页/共132页载体两性电解质的合成本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。pH范围：pH310丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB）加成反应第116
38、页/共132页第117页/共132页没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。第118页/共132页 （二）引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。第119页/共132页电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应：正极端反应：6H2OO2+4H3O+4e-负极端反应：4H2O+4e-2H2+4OH-第120页/共132页pH+-在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液，造成了在
39、电极附近pH的急剧变化。第121页/共132页pH+-pH=pHA-由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它带负电荷，朝正极移动。第122页/共132页pH+-同样载体两性电解质中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而会形成一个pH梯度。第123页/共132页等电聚焦的介质：1.液体介质：蔗糖2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG 作用：防止扩散，抗对流第124页/共132页 优点1.分辨率高，灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。2.电泳区带相当狭窄。3.重复性好。第125页/共132页 缺点1.
40、要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。第126页/共132页固相pH梯度等电聚焦原理：固相pH梯度等电聚焦（Immobilized pH gradients isoelectric focusing,IPGIEF）是80年代建立起来的一种新型等电聚焦技术。其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物。它们与丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。第127页/共132页 安马西亚商品名为Immobiline。它的结构式是：O H CH2 CH C N R (R代表羧基或第三氨基)Immobiline分
41、子的一端是一个双键，可以在聚合过程中通过共价结合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以即使在电场中，也是“固相”的。第128页/共132页 在分子的另一端是一个缓冲基团R，R为弱酸或弱碱，它可以在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系。固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。第129页/共132页等点聚焦电泳的应用 1.分析分离制备蛋白质、多肽2.测定蛋白质pI，鉴定蛋白质、多肽3.用于双向电泳第130页/共132页双向电泳第131页/共132页感谢您的观看！第132页/共132页