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1、会计学1核酸核酸(h sun)提取与鉴定提取与鉴定第一页,共55页。核酸(h sun)的提取与鉴定第一节 预处理 第二节 DNA的提取(tq)第三节 RNA的提取(tq)第四节 核酸的鉴定 概述 第1页/共54页第二页,共55页。研究研究(ynji)对象:基因组对象:基因组DNA、质粒、质粒DNA、总、总RNA、mRNA过程过程(guchng):裂解:破碎裂解:破碎(p su)(p su)细胞,使细胞中的核酸细胞,使细胞中的核酸游离在裂解体系中游离在裂解体系中 纯化:纯化:使核酸与其它杂质彻底分离,如使核酸与其它杂质彻底分离,如蛋白质、盐等蛋白质、盐等一、概一、概 述述 总原则:总原则:应保证
2、核酸一级结构的完整性;应保证核酸一级结构的完整性;排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。鉴定:鉴定:浓度、纯度、分子量、测序浓度、纯度、分子量、测序 (技术:分光光度技术、凝胶电泳技术等)(技术:分光光度技术、凝胶电泳技术等)第2页/共54页第三页,共55页。1 1、植物样品、植物样品 新鲜组织先用无菌生理盐水新鲜组织先用无菌生理盐水(shnglynshu)(shnglynshu)洗;洗;干药材除去霉点,无菌水浸洗;干药材除去霉点,无菌水浸洗;(一)样品预处理(获取分散(一)样品预处理(获取分散(fnsn)细胞)细胞)捣碎(do su)或剪碎;加液氮研磨成粉状。第3页/共54页第四页,共55
3、页。2、动物(dngw)样品(1 1)组织)组织)组织)组织(zzh)(zzh)样品:样品:样品:样品:新鲜样品,生理盐水洗,直接使用新鲜样品,生理盐水洗,直接使用(shyng)(或分装、(或分装、-70/液氮低温保存);液氮低温保存);甲醛固定组织甲醛固定组织要先去掉甲醛;石蜡包埋组织石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。第4页/共54页第五页,共55页。(2 2)血细胞样品)血细胞样品)血细胞样品)血细胞样品(yngpn)(yngpn):(3 3)培养)培养)培养)培养(piyng)(piyng)细胞:细胞:细胞:细胞:离心,弃细胞培养离心,弃细胞培养离心,弃细胞培养离心,弃细胞培
4、养(piyng)(piyng)液;液;液;液;用缓冲液多次漂洗;用缓冲液多次漂洗;用缓冲液多次漂洗;用缓冲液多次漂洗;来源来源(liyun):新鲜血液或者冻贮血液;:新鲜血液或者冻贮血液;抗凝剂:抗凝剂:一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠(枸橼酸钠柠檬酸钠(枸橼酸钠),),不可使用肝素;肝素;分离:分离:红白细胞,一般用明胶,加缓冲液悬浮白细胞。(血清(血清DNA是研究肿瘤的材料之一)是研究肿瘤的材料之一)第5页/共54页第六页,共55页。3、微生物培养物样品离心(lxn)获取菌体细胞,加缓冲液洗涤,加缓冲液悬浮菌体细胞。4、微生物混合样品用缓冲液悬浮菌体,低速离心,沉淀杂质。高速(o s)离心
5、获取菌体细胞。用缓冲液洗涤菌体细胞。加缓冲液悬浮菌体细胞。第6页/共54页第七页,共55页。(二)提取(二)提取(tq)用具用具预处理预处理1 1、DNADNA提取用具的处理提取用具的处理 要求无菌;试剂、器材要求无菌;试剂、器材(qci)(qci)高高压干燥等进行无压干燥等进行无DNADNA酶处理。酶处理。2 2、RNARNA提取用具提取用具(yngj)(yngj)的处理的处理要求无菌,防止二次污染。RNA易被RNase水解,RNase无处不在且耐高温,提取条件要求严格。第7页/共54页第八页,共55页。二、真核生物基因组二、真核生物基因组DNADNA的常规的常规(chnggu)(chngg
6、u)提取提取裂解裂解(li ji)细胞,溶细胞,溶出出DNA除去除去(ch q)杂质杂质重新溶解重新溶解DNA沉淀、浓缩沉淀、浓缩DNA第8页/共54页第九页,共55页。破碎细胞,溶解破碎细胞,溶解(rngji)DNA(rngji)DNA:用提取液(裂解液)破坏细胞壁、细胞膜和核膜。用提取液(裂解液)破坏细胞壁、细胞膜和核膜。微生物样品提取液:含表面活性剂微生物样品提取液:含表面活性剂SDSSDS、溶菌酶等、溶菌酶等动物样品提取液:含动物样品提取液:含SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K等等植物样品提取液:含植物样品提取液:含CTABCTAB核酸酶可被核酸酶可被Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+
7、等激活,提取液均含有螯合剂(如等激活,提取液均含有螯合剂(如EDTAEDTA,柠,柠檬酸等),螯合这些离子。檬酸等),螯合这些离子。第9页/共54页第十页,共55页。2 2、除去、除去(ch q)(ch q)杂质(主要是蛋白质)杂质(主要是蛋白质)(SDSSDS,破膜、蛋白质变性沉淀),破膜、蛋白质变性沉淀)苯酚抽苯酚抽提蛋白质提蛋白质氯仿抽提、萃取苯酚氯仿抽提、萃取苯酚经离心后溶液分为三层:上层是核酸溶液、经离心后溶液分为三层:上层是核酸溶液、中间中间(zhngjin)(zhngjin)不溶物为变性蛋白质,下不溶物为变性蛋白质,下层是苯酚氯仿溶液。层是苯酚氯仿溶液。蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯
8、仿核酸溶液核酸溶液第10页/共54页第十一页,共55页。3.沉淀DNA有机溶剂沉淀DNA:2倍体积无水乙醇(或1倍体积的异戊醇)再用75%乙醇清洗多次。4.重新(chngxn)溶解DNA将DNA溶于水或TE溶液。第11页/共54页第十二页,共55页。qCTABCTAB法原理(植物法原理(植物DNADNA提取提取(tq)(tq)经经典方法)典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。与核酸形成复合物。该复合物在高盐
9、溶液中(该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖(du tn)、酚类等杂质后加、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注:CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出(xch),因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。基因组基因组DNACTAB法法第12页/共54页第十三页,共55页。q SDS法原理法原理(yunl)基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂,在在高高温温(5565)条条件件下下能能裂解细胞裂解
10、细胞(xbo),使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度(冰冰浴浴),使使蛋蛋白白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提,反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相中的相中的DNA。第13页/共54页第十四页,共55页。DNA提取的一般提取的一般(ybn)流程流程第14页/共54页第十五页,共55页。三、质粒三、质粒DNADNA的提取的提取(tq)(tq)质粒质粒DNADNA特点:特点:(1 1)细菌基因)细菌基
11、因(jyn)(jyn)组组DNADNA以外的小型闭合环状双链以外的小型闭合环状双链DNADNA分子。分子。(2 2)大都含有抗生素抗性基因)大都含有抗生素抗性基因(jyn)(jyn)。(3 3)可自我复制或表达。(重组)可自我复制或表达。(重组DNADNA技术中构建载体)技术中构建载体)(4 4)大小)大小1-300 kb1-300 kb。第15页/共54页第十六页,共55页。1 1、培养、培养(piyng)(piyng)细菌和扩增细菌和扩增质粒质粒n 加适当的抑制剂(如氯霉素),抑制细菌蛋白加适当的抑制剂(如氯霉素),抑制细菌蛋白质合成,抑制细胞分裂,但质粒会继续质合成,抑制细胞分裂,但质粒
12、会继续(jx)复制。复制。第16页/共54页第十七页,共55页。2 2、收获、收获(shuhu)(shuhu)细菌和溶细菌和溶菌菌 离心收集细菌细胞。离心收集细菌细胞。细菌裂解细菌裂解(li ji)(li ji)方法:方法:机械法机械法 化学试剂法化学试剂法 (SDSSDS)溶菌酶化学试剂联合法(最常用)溶菌酶化学试剂联合法(最常用)第17页/共54页第十八页,共55页。3 3、分离、分离(fnl)(fnl)质粒质粒DNADNA基因组基因组DNADNA与质粒与质粒DNADNA分离分离(fnl)(fnl)碱裂解法(最常用碱裂解法(最常用(chn(chn yn)yn))用溶液用溶液1 1(EDTA
13、EDTA)悬浮菌体。)悬浮菌体。溶液溶液2 2(NaOHNaOH和和SDSSDS)裂解菌体,蛋白质与)裂解菌体,蛋白质与DNADNA发生变性。发生变性。溶液溶液3 3中和中和pHpH,质粒,质粒DNADNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,基因分子能够迅速复性,呈溶解状态,基因组组DNADNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。不复性与蛋白质形成絮状沉淀。离心后,质粒离心后,质粒DNADNA留在上清液中。留在上清液中。第18页/共54页第十九页,共55页。通过加热,使细菌裂解、蛋白质和通过加热,使细菌裂解、蛋白质和DNADNA变性。变性。降低温度,质粒降低温度,质粒DNADNA复性留于上清液,基因组复性留
14、于上清液,基因组DNADNA复性很慢与蛋复性很慢与蛋白质形成沉淀白质形成沉淀(chndin)(chndin),可通过离心除去。,可通过离心除去。煮沸裂解法(偶尔煮沸裂解法(偶尔(u r)(u r)用)用)梯度梯度(t d)(t d)离心法(极离心法(极少用)少用)基因组基因组DNADNA断裂,吸附大量断裂,吸附大量EBEB,密度大;质粒,密度大;质粒DNADNA密度小。密度小。利用氯化铯梯度离心,分离基因组利用氯化铯梯度离心,分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA。第19页/共54页第二十页,共55页。n n离心分离后,吸取含有离心分离后,吸取含有离心分离后,吸取含有离心分离后,吸取含
15、有(hn yu)(hn yu)(hn yu)(hn yu)质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA的上清液。的上清液。的上清液。的上清液。n n用苯酚、氯仿抽提,除去溶解于上清液中的蛋白质。用苯酚、氯仿抽提,除去溶解于上清液中的蛋白质。用苯酚、氯仿抽提,除去溶解于上清液中的蛋白质。用苯酚、氯仿抽提,除去溶解于上清液中的蛋白质。n n用乙醇或异戊醇沉淀质粒用乙醇或异戊醇沉淀质粒用乙醇或异戊醇沉淀质粒用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNADNADNADNA(与基因组(与基因组(与基因组(与基因组DNADNADNADNA方法同)。方法同)。方法同)。方法同)。4 4、质粒、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn
16、 hu)(chn hu)蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液第20页/共54页第二十一页,共55页。四、四、RNARNA的提取的提取(tq)(tq)(一)总RNA的提取(tq)所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即:样品细胞或组织的有效破碎(p su);有效地使核蛋白复合体变性;对内源RNA酶的有效抑制;有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。最关键的是抑制RNA酶的活性。第21页/共54页第二十二页,共55页。常用常用(chn yn)(chn yn)的的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RN
17、A酶抑制(yzh)剂。异硫氰酸胍:可裂解细胞并抑制(yzh)RNA酶,目前被认为是最有效的RNA酶抑制(yzh)剂。RNA酶的蛋白抑制(yzh)剂(RNAsin)等。第22页/共54页第二十三页,共55页。(1 1)提取)提取RNARNA所用所用(su yn)(su yn)器皿的处理及器皿的处理及溶液的准备溶液的准备n n塑料制品:使用灭菌的一次性用品。或用塑料制品:使用灭菌的一次性用品。或用0.1DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)。仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)。n n玻璃用品:使用前于玻璃用品:使用
18、前于180的高温下干烤的高温下干烤6h以上,或以上,或在在220下干烤下干烤3h以上。以上。n n有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤(xd),双,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再用蒸水冲洗,乙醇干燥,再用3H2O2室温浸泡室温浸泡10min,然后用,然后用0.1DEPC水冲洗,晾干。水冲洗,晾干。第23页/共54页第二十四页,共55页。n n所需溶液的配制:必须用高压灭菌的水和所需溶液的配制:必须用高压灭菌的水和所需溶液的配制:必须用高压灭菌的水和所需溶液的配制:必须用高压灭菌的水和RNARNA提取专提取专提取专提取专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,
19、用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,把溶液装入无把溶液装入无把溶液装入无把溶液装入无RNaseRNase的玻璃器皿。的玻璃器皿。的玻璃器皿。的玻璃器皿。n n严格来说,所有溶液均应用严格来说,所有溶液均应用严格来说,所有溶液均应用严格来说,所有溶液均应用0.10.1DEPCDEPC于于于于3737处理处理处理处理(chl)12(chl)12小时以上,然后于小时以上,然后于小时以上,然后于小时以上,然后于100100加热加热加热加热1515分钟或高压分钟或高压分钟或高压分钟或高压灭菌灭菌灭菌灭菌
20、1515分钟,去除残余分钟,去除残余分钟,去除残余分钟,去除残余DEPCDEPC。第24页/共54页第二十五页,共55页。n n 在涉及RNA的一切(yqi)操作过程中,都应戴一次性手套和口罩,应勤换手套。(2 2)RNARNA提取中提取中RNaseRNase污染污染(wrn)(wrn)的控制的控制 第25页/共54页第二十六页,共55页。第26页/共54页第二十七页,共55页。RNARNA的提取的提取(tq)(tq)方法方法 1 1、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法氯化铯超速离心法使用使用(shyng)(shyng)蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制
21、解组织和有效抑制RNARNA酶的活性;酶的活性;再进行再进行CsClCsCl密度梯度超速离心,密度梯度超速离心,RNARNA沉淀于管沉淀于管底,而底,而DNADNA与蛋白质在上清液中。与蛋白质在上清液中。这种方法能得到高质量的这种方法能得到高质量的RNARNA,同时分离出细,同时分离出细胞染色体胞染色体DNADNA。第27页/共54页第二十八页,共55页。2 2、盐酸、盐酸(yn sun)(yn sun)胍胍-有机溶剂法有机溶剂法n n利用盐酸(yn sun)胍使蛋白质变性,抑制RNA酶;3 3、氯化锂、氯化锂-尿素尿素(nio s)(nio s)法法利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶;
22、氯化锂选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染,氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA。第28页/共54页第二十九页,共55页。4 4、一步、一步(y b)(y b)快速热酚抽提法快速热酚抽提法n n将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDSSDS等联合使用,抑等联合使用,抑制制RNARNA的降解,裂解细胞,增强对核蛋白复合物的解离,的降解,裂解细胞,增强对核蛋白复合物的解离,使使RNARNA与蛋白质分离;与蛋白质分离;n n用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNADNA,乙醇或异,乙醇或异丙醇沉淀纯化丙醇沉淀纯化RNARNA。n
23、 n此法操作简便快速此法操作简便快速(kui s)(kui s),可在,可在3 3小时以内处理大批小时以内处理大批样品,对大量或少量组织的细胞样品,对大量或少量组织的细胞RNARNA提取均甚合适。提取均甚合适。第29页/共54页第三十页,共55页。5 5、试剂盒快速、试剂盒快速(kui s)(kui s)提取法提取法n n裂解液含胍盐,抑制裂解液含胍盐,抑制RNARNA酶,使蛋白质和酶,使蛋白质和DNADNA同时变性;同时变性;n n氯仿氯仿(l fn)(l fn)等抽提去除蛋白质和等抽提去除蛋白质和DNADNA;n n乙醇或异丙醇沉淀纯化乙醇或异丙醇沉淀纯化RNARNA;n n此法操作简便快
24、速。此法操作简便快速。第30页/共54页第三十一页,共55页。Trizol一步(y b)提取总RNA:TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞(xbo),使细胞(xbo)中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。第31页/共54页第三十二页,共55页。1)实验前取冰,)实验前取冰,4离心机预冷,离心机预冷,DEPC处理水(高压处理水(高压(goy)灭菌处理)配制的灭菌处理)配制的75%乙醇
25、乙醇4预冷;预冷;步骤(bzhu):2)1ml Trizol匀浆匀浆(yn jin)好的样品;好的样品;3)加入)加入0.2ml氯仿氯仿,颠倒颠倒混匀(混匀(15秒秒)“慢慢”,氯仿使蛋白变性,氯仿使蛋白变性4)室温室温,静置,静置3分钟分钟;5)离心机)离心机4、14000转转/分,离心分,离心15分钟分钟;静置;静置1分钟分钟(分层即(分层即可;样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,可;样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主主要存在于水相中)要存在于水相中)6)取上清取上清0.5ml(注意:取最上层水相,小心污染,宁可吸少点也(注意:取最上层水相,小心污
26、染,宁可吸少点也不要吸到中间层的物质)不要吸到中间层的物质)放入另一个放入另一个1.5ml的的EP管中;管中;7)加入等体积的)加入等体积的异丙醇异丙醇(0.5ml),涡旋混匀;),涡旋混匀;第32页/共54页第三十三页,共55页。8)室温,静置)室温,静置10分钟(该条件由分钟(该条件由Trizol试剂盒提供;其他试剂盒提供;其他(qt)提供的条件用提供的条件用-20、1小时,目的为了更好分层)小时,目的为了更好分层)9)离心)离心(lxn)机机4、14000转转/分,离心分,离心(lxn)10分钟分钟10)弃上液)弃上液(移液器调至移液器调至1ml,分两步快速轻轻吸弃上清:第,分两步快速轻
27、轻吸弃上清:第1步,步,沿液面吸弃约沿液面吸弃约0.9ml上清;第上清;第2步,沿液面吸弃其余步,沿液面吸弃其余(qy)上清上清;注意注意吸头不要接触到沉淀斑区)吸头不要接触到沉淀斑区)11)沿试管内壁轻轻加入沿试管内壁轻轻加入1ml 4预冷的预冷的75%乙醇乙醇,注意切勿冲击注意切勿冲击到沉淀斑区到沉淀斑区12)离心机)离心机4、10000转转/分,离心分,离心5分钟分钟13)弃上液弃上液(用枪把里面的乙醇吸去,留极少许即可,以防干燥过(用枪把里面的乙醇吸去,留极少许即可,以防干燥过程中把程中把RNA烤干),烤干),60恒温箱干燥恒温箱干燥5分钟分钟(注意:打开管盖;或用真(注意:打开管盖;
28、或用真空干燥空干燥5分钟)分钟)14)加入)加入50l DEPC处理水处理水溶解溶解(可以根据管底的白色沉淀判断(可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的多少加量的多少加DEPC处理水)处理水)15)-80冰箱保存。冰箱保存。第33页/共54页第三十四页,共55页。组织(zzh)匀浆 第34页/共54页第三十五页,共55页。(二)(二)mRNA的提取的提取(tq)从总从总RNARNA中分离中分离mRNAmRNA,用用OligoOligo(dTdT)层析柱。)层析柱。mRNAmRNA含含polyApolyA,在高盐浓度条件下,在高盐浓度条件下与与OligoOligo(dTdT)结合,其他)结合,其他
29、(qt)(qt)成分被洗掉,再用低盐浓成分被洗掉,再用低盐浓度洗脱度洗脱mRNAmRNA。第35页/共54页第三十六页,共55页。(一)核酸浓度(nngd)检测 OD2601时(比色皿厚度时(比色皿厚度(hud)1.0cm)双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml,单链单链DNA或或RNA浓度为浓度为40 g/ml。DNA(g/ml)=OD26050RNA(g/ml)=OD26040五、核酸五、核酸(h sun)(h sun)的鉴定的鉴定第36页/共54页第三十七页,共55页。(二)核酸纯度(二)核酸纯度(chnd)检测(紫外吸检测(紫外吸收法)收法)n n核酸核酸(h sun)(h sun)
30、在在260 nm260 nm处有吸收峰,蛋白质在处有吸收峰,蛋白质在280 nm280 nm有有吸收峰吸收峰n n核酸核酸(h sun)(h sun)的纯度用的纯度用OD260/OD280OD260/OD280比值表示。比值表示。DNA样品:样品:OD260/OD280 1.8,DNA纯度高纯度高OD260/OD280 1.8,含,含RNA,或,或DNA部分降部分降解解(jin ji)OD260/OD280 1.8,含苯酚或蛋,含苯酚或蛋白杂质白杂质RNA样品:样品:OD260/OD280 1.82.0 RNA纯度高纯度高 2.0,RNA出现降出现降解解(jin ji)第37页/共54页第三十
31、八页,共55页。(三)核酸(三)核酸(h sun)(h sun)完整性检测完整性检测n n核酸样本的完整性和分子量可通过核酸样本的完整性和分子量可通过(tnggu)(tnggu)琼脂糖琼脂糖凝胶电泳测定(凝胶电泳测定(RNARNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳)常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳),溴化乙锭染色,紫外灯观察。,溴化乙锭染色,紫外灯观察。凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带,其中(qzhng)28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍,5s rRNA 较弱。电泳:带电颗粒在电场的作用下发生
32、迁移。第38页/共54页第三十九页,共55页。根据电泳支持介质根据电泳支持介质(jizh)分为分为琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳:多用于鉴定较大核酸多用于鉴定较大核酸(h sun)片段(片段(0.160 kb)聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶电泳:用于鉴定较小的核酸用于鉴定较小的核酸(h sun)片段(片段(501000 bp)六、电泳六、电泳(din yn)第39页/共54页第四十页,共55页。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n n琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度,低浓度的琼脂糖形成(xngchng)较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成(xn
33、gchng)较小的孔径。琼脂糖浓度()线型DNA分子的分离范围(kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12第40页/共54页第四十一页,共55页。琼脂糖凝胶电泳装置琼脂糖凝胶电泳装置(zhungzh)(zhungzh)第41页/共54页第四十二页,共55页。n n琼脂糖凝胶电泳有许多琼脂糖凝胶电泳有许多(xdu)优点:优点:n n操作简单,电泳速度快,分离核酸范围广;操作简单,电泳速度快,分离核酸范围广;n n电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好;电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好;n n电泳后区带易染色,便于定量测定;电泳后区带易染色,
34、便于定量测定;n n可用于核酸的纯化和分离(电洗脱法);可用于核酸的纯化和分离(电洗脱法);n n可制成干膜可长期保存。可制成干膜可长期保存。第42页/共54页第四十三页,共55页。n nRNARNA可以使用非变性可以使用非变性可以使用非变性可以使用非变性(binxng)(binxng)或变性或变性或变性或变性(binxng)(binxng)凝胶凝胶凝胶凝胶电泳进行检测。电泳进行检测。电泳进行检测。电泳进行检测。n n在非变性在非变性在非变性在非变性(binxng)(binxng)电泳中,可以分离混合物中不同电泳中,可以分离混合物中不同电泳中,可以分离混合物中不同电泳中,可以分离混合物中不同分
35、子量的分子量的分子量的分子量的RNARNA分子,但是无法确定分子量。分子,但是无法确定分子量。分子,但是无法确定分子量。分子,但是无法确定分子量。第43页/共54页第四十四页,共55页。RNA变性电泳:变性电泳:RNA为单链分子,局部形成发卡结构,直接为单链分子,局部形成发卡结构,直接(zhji)电泳无法确定分子量。电泳无法确定分子量。只有在变性情况下,只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,迁移分子完全伸展,迁移率才与分子量成正比。率才与分子量成正比。方法:方法:电泳前样品保温电泳前样品保温60,RNA分子伸展。分子伸展。凝胶中加有甲醛,使凝胶中加有甲醛,使RNA在电泳过程中保持单在电泳过程中
36、保持单链结构。链结构。第44页/共54页第四十五页,共55页。n n操作流程大致为:操作流程大致为:n n 凝胶的制备凝胶的制备加样加样电泳电泳染色染色(rns)观察观察和拍照和拍照电泳电泳(din yn)缓冲液:缓冲液:TAE、TBE(用于电泳(用于电泳(din yn)和制胶)和制胶)第45页/共54页第四十六页,共55页。上样缓冲液:上样缓冲液:制胶制胶第46页/共54页第四十七页,共55页。加样加样第47页/共54页第四十八页,共55页。常常常常用用用用(c(chhn n yyn n)的的的的电电电电泳泳泳泳缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液电泳电泳(din yn)过程过程电泳电泳(din yn)
37、第48页/共54页第四十九页,共55页。DNA电泳电泳(din yn)(紫外灯)(紫外灯)第49页/共54页第五十页,共55页。基因组基因组DNA抽提结果抽提结果(ji gu)电泳图电泳图 第50页/共54页第五十一页,共55页。总总RNARNA抽提结果抽提结果(ji gu)(ji gu)电泳图电泳图 mRNA利用利用利用利用(lyng)(lyng)凝胶电泳进行核酸的纯化和凝胶电泳进行核酸的纯化和凝胶电泳进行核酸的纯化和凝胶电泳进行核酸的纯化和回收(电洗脱法)回收(电洗脱法)回收(电洗脱法)回收(电洗脱法)第51页/共54页第五十二页,共55页。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 n n聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持(zhch)介质。凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定。分辨力高于琼脂糖凝胶电泳,主要用于分子量小的DNA的分离,或在DNA测序中使用,操作复杂。第52页/共54页第五十三页,共55页。聚丙烯酰胺凝胶制胶装置聚丙烯酰胺凝胶制胶装置(zhungzh)第53页/共54页第五十四页,共55页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第54页/共54页第五十五页,共55页。