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1、会计学1核酸电泳核酸电泳(din yn)与检测与检测第一页，共54页。n n核酸凝胶电泳n n用于分离(fnl)、鉴定和纯化DNA或RNA片段n n优点：n n便于分离(fnl)；便于检测；便于回收第1页/共53页第二页，共54页。1.1.基本原理基本原理 n n琼脂糖凝胶电泳是以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到(d do)分离混合物的目的。n n(1)电荷效应n n 在 pH 值为 8.08.3 时，DNA分子在高于其等电点的溶液中,核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。第2页/共53页第三页，共54页。(2)分子筛效
2、应 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移(qiny)速度取决于分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移(qiny)率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，cccDNAIDNAocDNA 第3页/共53页第四页，共54页。（3）DNA分子的大小 在凝胶中，DNA片段(pin dun)迁移距离（迁移率）与碱基对的对数值成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段(pin dun)的移动距离时行比较，便可测出未知片段(pin dun)的大小。第4页/共53页第五页，共54页。根据标准(biozhn)DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小第5页/共53
3、页第六页，共54页。如何提高如何提高(t go)核酸电泳的分辨率？核酸电泳的分辨率？第6页/共53页第七页，共54页。（4）凝胶电泳(din yn)的分辨力与凝胶的类型和密度相关一、凝胶类型1.琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间(20kb);可区分相差loobp的DNA片段，常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳(din yn)。2.聚丙烯酰胺凝胶用于分离5500bp的片段;垂直装置进行电泳(din yn)效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析 第7页/共53页第八页，共54页。不同浓度琼脂糖的凝胶分离不同浓度琼脂糖的凝胶分离(
4、fnl)范范围围琼脂糖浓度（，琼脂糖浓度（，W/V)DNA分子的有效分离分子的有效分离(fnl)范围（范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2二、凝胶的密度(md)第8页/共53页第九页，共54页。可以通过提高琼脂糖的浓度减小凝胶孔径来提高电泳(din yn)分辨率。或者改用聚丙烯酰胺凝胶。还可以降低跑电泳(din yn)的电压，增大跑电泳(din yn)的时间等。如何提高如何提高(t go)核酸核酸电泳的分辨率？电泳的分辨率？第9页/共53页第十页，共54页。2.影响影响DNA在凝胶中迁移在凝胶中迁移(qiny)速率的因素：速率
5、的因素：（1）DNA分子的大小(dxio)：双链线状DNA分子迁移的速率与其碱基对数值近似成反比。样品分子越大，在通过胶孔时的摩擦阻滞力越大，泳动速度越慢。第10页/共53页第十一页，共54页。（2）构象(u xin)：超螺旋环状线状切口环状第11页/共53页第十二页，共54页。（3）凝胶浓度：浓度越低，相同核酸分子迁移越快。凝胶浓度愈低,则凝胶孔径愈大(但凝胶的强度也愈低)。一般(ybn)地分子量越大,选用的凝胶浓度应越小。第12页/共53页第十三页，共54页。（4）电压:低电压时DNA片段迁移率与所用电压成正比。但随着电压上升,不同(b tn)长度DNA泳动的增加程度不同(b tn)，分辨
6、率会降低第13页/共53页第十四页，共54页。（5）离子强度缓冲液中无离子时,DNA几乎不移动。而在高离子强度下，导电性极高,带电颗粒(kl)泳动很快,并产生大量的热,有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。第14页/共53页第十五页，共54页。n n电泳缓冲液电泳缓冲液TAE TBE TPETAE TBE TPE三者区别三者区别n n（1 1）缓冲容量：）缓冲容量：TAETAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化。此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化。n n TBE TBE和和TPETPE比比TAETAE花费贵，但有高得多的缓冲容量。花
7、费贵，但有高得多的缓冲容量。n n（2 2）迁移速度：双链线状）迁移速度：双链线状DNADNA片段中片段中TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中中迁移快迁移快10%10%，n n（3 3）分辨率：对于）分辨率：对于(duy)(duy)高分子质量的高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率的分辨率略高于略高于TBETBE或或TPETPE，对于，对于(duy)(duy)低分子质量的低分子质量的DNADNA，TAETAE要差要差些。超螺旋些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳分辨率要好于中的电泳分辨率要好于TBETBE。n nTBETBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此
8、缺点，室温下贮存浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存55溶液溶液 第15页/共53页第十六页，共54页。（5）溴化乙锭 在DNA电泳中,溴化乙锭染料可插入(ch r)到碱基对中,从而增加线性及开环DNA的长度。加溴化乙锭后进行电泳,可使DNA的泳动速度降低达15%。第16页/共53页第十七页，共54页。3.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n n琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热至90左右,即可熔化(rnghu)形成清亮、透明的液体,待冷至40-45时则可固化形成凝胶。第17页/共53页第十八页，共54页。n n基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取
9、出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存(bocn)结果 n n注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套第18页/共53页第十九页，共54页。（1）琼脂糖凝胶电泳的基本(jbn)过程第19页/共53页第二十页，共54页。第20页/共53页第二十一页，共54页。n n上样缓冲液的三个作用n n（1）增加样品密度(md)保证DNA沉入加样孔内n n（2）使样品带有颜色便于简化上样过程n n（3）其中的染料在电场中可以预测泳动速率向阳极迁移。第21页/共53页第二十二页，共54页。
10、n n6*上样缓冲液成分(chng fn)：第22页/共53页第二十三页，共54页。（2）琼脂糖凝胶中）琼脂糖凝胶中DNA的检测的检测(jin c)通过染色通过染色,紫外灯下检测紫外灯下检测(jin c)。主要有溴化乙锭（主要有溴化乙锭（ethidium bromide,EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。第23页/共53页第二十四页，共54页。凝胶的凝胶的EB染色染色(rns)（1）EB被认为被认为(rnwi)是是一种强致癌物质一种强致癌物质,见光分解。见光分解。（2）EB可用来检测单链或可用来检测单链或双链核酸双链核酸第24页/共53页第二十五页，共54页。（3 3）
11、EBEB使用时的配制、贮存使用时的配制、贮存(zhcn)(zhcn)及及使用使用 EB EB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml10 mg/ml的贮存的贮存(zhcn)(zhcn)液，于室温保存在棕色瓶或用液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 0.5 g/ml g/ml。（4 4）当要知道）当要知道DNADNA片段准确大小时，凝胶片段准确大小时，凝胶应在无应在无EBEB情况下电泳，电泳结束后再用情况下电泳，电泳结束后再用EBEB染色。染色。第25页/共53页第二十六页，共54页。EB替代品替代品 SYBR Gold SYBR Gold是一
12、种新型极敏感染料的商品是一种新型极敏感染料的商品名称。其与名称。其与DNADNA结合结合(jih)(jih)的亲和力高，的亲和力高，并且结合并且结合(jih)(jih)后，能够极大增强荧光后，能够极大增强荧光信号。信号。第26页/共53页第二十七页，共54页。n nsybr-green、sybrgold-不稳定不稳定(wndng)，毒性也很大，毒性也很大 n ngoldview-宣称无毒宣称无毒,不灵敏不灵敏,回收连接不好回收连接不好,荧光易猝灭。对于大片段荧光易猝灭。对于大片段DNA的染色效果的染色效果还凑合，但是在对于还凑合，但是在对于500bp以下的片段效果以下的片段效果不是很好。不是很
13、好。n nGelRed/GelGreen低毒低毒,效果很强效果很强!但价格昂但价格昂贵。贵。第27页/共53页第二十八页，共54页。第28页/共53页第二十九页，共54页。（3）结果）结果(ji gu)分析分析n n提取(tq)细菌基因组电泳图第29页/共53页第三十页，共54页。琼脂糖凝胶电泳检测(jin c)细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成PCR产物(chnw)的电泳第30页/共53页第三十一页，共54页。n nRNA电泳图第31页/共53页第三十二页，共54页。4.注意事项注意事项n n1、溴乙锭(EB)是诱变剂，应戴乳胶手套。凡是(fnsh)沾污过溴乙锭的器皿或物品,必须经专
14、门处理后，才能进行清洗或弃去。n n2、加样量的多少决定于加样孔最大容积。加入样品的体积应略少于加样孔容积。n n第32页/共53页第三十三页，共54页。5.常见问题与对策常见问题与对策(duc)DNA带很淡或无带 第33页/共53页第三十四页，共54页。n nDNA带拖尾 第34页/共53页第三十五页，共54页。第35页/共53页第三十六页，共54页。第36页/共53页第三十七页，共54页。6.DNA浓度和纯度浓度和纯度(chnd)的测定的测定紫外吸收法、定磷法（1）目测条带亮度来判断DNA浓度跑胶时候marker 按说明书的量上样电泳，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和marker 条带的
15、亮度做个大致的比较(bjio)。找出两者最接近亮度的条带。根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，如果质粒的量很浓的话。第37页/共53页第三十八页，共54页。（2）分光光度法）分光光度法 DNA或或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在收，其吸收峰在260nm处。处。波长为波长为260nm时，时，DNA或或RNA的光密度的光密度OD260不仅与不仅与总含量有关，也随构型而有差异。总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为对标准样品来说，浓度为1g/ml时，时，DNA
16、钠盐的钠盐的OD2600.02当当OD2601时，时，dsDNA浓度约为浓度约为50g/ml ssDNA浓度约为浓度约为37g/ml RNA浓度约为浓度约为40g/ml 寡核苷酸浓度约为寡核苷酸浓度约为30g/ml（由于底（由于底物物(d w)不同有差异不同有差异第38页/共53页第三十九页，共54页。n n当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定(cdng)。n n一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。第39页/共53页第四十页，共54页。n n经验值：n n纯DNA：OD260/OD2801.8(1
17、.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染）n n纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）n n若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量(dngling)，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。第40页/共53页第四十一页，共54页。操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤1 1、UV-240 UV-240紫外分光光度计开机预热紫外分光光度计开机预热紫外分光光度计开机预热紫外分光光度计开机预热10min.10min.2 2、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入用重
18、蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TETE缓冲液后，放缓冲液后，放缓冲液后，放缓冲液后，放入样品室的入样品室的入样品室的入样品室的S S池架上，关上盖板。池架上，关上盖板。池架上，关上盖板。池架上，关上盖板。3 3、设定狭缝后校零。设定狭缝后校零。设定狭缝后校零。设定狭缝后校零。4 4、将标准将标准将标准将标准(biozh(biozh n)n)样品和待测样品适当稀释（样品和待测样品适当稀释（样品和待测样品适当稀释（样品和待测样品适当稀释（DNA5lDNA5l或或或或RNA4lRNA4l用用用用TETE缓冲液稀释至缓冲液稀释至缓冲液稀释至缓冲液稀释至1000l1
19、000l）后，记录编号和稀释度。）后，记录编号和稀释度。）后，记录编号和稀释度。）后，记录编号和稀释度。5 5、把装有标准把装有标准把装有标准把装有标准(biozh(biozh n)n)样品或待测样品的比色皿放进样品样品或待测样品的比色皿放进样品样品或待测样品的比色皿放进样品样品或待测样品的比色皿放进样品室的室的室的室的S S架上，关闭盖板。架上，关闭盖板。架上，关闭盖板。架上，关闭盖板。6 6、设定紫外光波长，分别测定设定紫外光波长，分别测定设定紫外光波长，分别测定设定紫外光波长，分别测定230nm230nm、260nm260nm、280nm280nm波长时波长时波长时波长时的的的的ODOD
20、值。值。值。值。7 7、计算待测样品的浓度与纯度。计算待测样品的浓度与纯度。计算待测样品的浓度与纯度。计算待测样品的浓度与纯度。DNADNA样品的浓度（样品的浓度（样品的浓度（样品的浓度（g/lg/l）:OD260:OD260稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数50/100050/1000RNARNA样品的浓度（样品的浓度（样品的浓度（样品的浓度（g/lg/l）：）：）：）：OD260OD260稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数40/100040/1000第41页/共53页第四十二页，共54页。（3）溴化乙锭法 溴化乙锭（EB）插入堆积碱基之间。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。荧光强度
21、正比于嵌入溴化乙锭的量。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有关，对于单一构型的同种(tn zhn)DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比。第42页/共53页第四十三页，共54页。基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行(jnxng)，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA RNA 电电 泳泳第43页/共53页第四十四页，共54页。n n如何通过分析电泳图谱评判基因组DNA、质粒DNA等的提取物的质量？n n为什么我的PCR产物(chnw)跑电泳时发生拖尾？n n解决办法？第44页/共53页第四十五页，共54页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第53页/共53页第五十四页，共54页。