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1、细胞培养的目的与用途2一、基础研究(1)药物作用机理(2)基因功能(3)疾病发生机理二、科学研究:(1)新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等.(2)疫苗研究与开发:如肝炎疫苗,艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等.(3)基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发(4)单克隆抗体制备第1页/共22页细胞培养主要的设施器材2设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。器材：一、玻璃器材玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。二、塑料器材多孔培养板（6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。三、橡皮器材橡皮制品（最好是硅制品）做
2、各种瓶或试管的塞子、盖子。四、金属器材剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头五、其他物品纱布、注射器、针头、滤头第2页/共22页细胞培养的条件（1）适宜的温度和PH37，pH7.27.4。（2）气体环境95%空气+5%CO2;适宜的湿度（无菌水不能干掉）。（CO2：细胞生长所必需的成分,pH值维持，最低不能低于1%。）（3）营养物质N源、C源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199等。（4）无菌条件紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。第3页/共22页设施、器材、试剂实物图第4页/共22页
3、培养细胞的分类按照是否贴壁：贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等。悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。按照传代次数：原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之内的细胞统称为原代细胞。）细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、CHO细胞等。第5页/共22页原代培养原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。第6
4、页/共22页原代消化培养法（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟。（2）剪切：将组织切成23毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。（3）消化：置于37温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。（4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（5001000转/分）离心收集细胞，弃上清。（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。（6）培养：置于37，5%CO2温箱
5、培养。第7页/共22页原代组织块培养法 （1）剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。（2）摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布2030块。（3）轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，置36.5温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。（4）培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。第8页/共22页细胞的传代细胞传代的
6、概念：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）。传代方法：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。第9页/共22页细胞的传代悬浮细胞传代：（1）收集细胞悬液；（2）离心（1000转/分，2分钟）；（3）弃上清；（4）加入新鲜培养基重悬细胞；（5）按照适当比例接种到新的培养皿；（6）补足培养基；（7）放于温箱培养。重悬分装放入温箱第10页/共22页细胞的传代贴壁细胞的传代：（1）吸去
7、陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面；（2）加入胰酶消化细胞；（3）加入新鲜培养基终止胰酶消化；（4）将细胞吹打下来，收集，离心；（5）弃上清；（6）加入新鲜培养基重悬细胞；（7）按照适当比例接种到新的培养皿；（8）补足培养基；（9）放于温箱培养。终止胰酶消化并吹打重悬分装放入温箱吸去旧培养基，PBS清洗加入胰酶消化第11页/共22页细胞的换液悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、PBS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。第12页/共22页细胞的冻存悬浮细胞的冻存：（1）配制冻
8、存液（胎牛血清：二甲基亚砜9:1），每个冻存管需要冻存液1ml。（2）收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80冰箱，第二日转存于液氮中。第13页/共22页细胞的冻存贴壁细胞的冻存：（1）配制冻存液。（2）弃去陈旧培养基，PBS清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化，吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入-80冰箱，第二日转存于液氮中。吸去旧培养基，PBS清洗加入胰酶消化终止胰酶消化并吹打第14页/共22页细胞冻存的注意事项：（1）冻存液要最先配置。原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热
9、损伤细胞。原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。（2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。（3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。（4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1，细胞冻 存盒应先放在4 预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻 存盒，则采用程序降温法。（4冰箱40min，-20冰箱30-60min，置于-80 过夜，次日转入液氮。）第15页/共22页细胞的复苏悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在
10、于复苏后死细胞的清除方法。复苏流程：（1）取一支离心管，加入3ml的新鲜培养基备用。（2）取出冻存的细胞，于37的温水中，1min之内迅速融化。（3）迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，1000转/分钟，离心1分钟。（4）弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。（5）接种到培养皿（瓶）内，补足培养基，放入温箱培养。补足培养基放入温箱重悬3ml新鲜培养基备用1min之内解冻迅速倒入第16页/共22页细胞的复苏复苏后死细胞的清除方法：悬浮细胞：细胞复苏后，每2天按照2:1或3:1的比例传代一次，大约1周后，细胞生长状态良好。贴壁细胞：细胞复苏后6h（此时已有细胞贴壁），吸去培养基（含有大量死细胞）
11、，重新加入新鲜培养基。第17页/共22页细胞复苏的注意事项（1）细胞复苏原则：快速融化（快融）。（2）尽量减少室温下DMSO和细胞接触的时间。预先准备好离心管并加入新鲜培养液；在1分钟之内将细胞融化；立刻将融化后的细胞倒入离心管中。（3）复苏时，离心时间不宜过长，1分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤，降低细胞存活率。（4）死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。（5）如果复苏不成功，更可能是因为冻存或保存过程中出现问题。第18页/共22页细胞污染时的处理有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下
12、办法清除。（1）使用抗生素污染后清除用药需采用大于常用量510倍的冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。（2）加温处理将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。若先用药物处理后，再以41加温处理效果更佳。第19页/共22页其他注意事项（1）细胞房要定期擦拭：包括地面、桌面、超净台等，先用自来水擦拭，再用消毒液（3 的来苏尔或者新洁尔灭）擦拭，之后打开紫外灯，照射2h。（2）细胞培养箱定期灭菌：将培养箱中的铁架取出，高压灭菌，箱内壁用75%酒精擦拭，再用消毒液擦拭，紫外照射过夜。（3）及时更换CO2罐和HEPA过滤器，确保培养箱中有充足的无菌水。（4）及时补充液氮，不可使细胞露出液氮表面。（5）进入细胞房要更换无菌服，带好手套、口罩、鞋套等。第20页/共22页Thank You!第21页/共22页感谢您的观看！第22页/共22页