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1、体外培养的基本原理与技术体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法第1页/共85页二、体外培养的基本方法和过程植块植块（explantexplant）：从动物体内取出，用于培养的小块组织一般称为从动物体内取出，用于培养的小块组织一般称为外植块外植块或或简称简称植块植块。分离（散）细胞分离（散）细胞isolatedisolated（dissociateddissociated）cellcell：由组织块分散后制成的单个细胞一般称之
2、。由组织块分散后制成的单个细胞一般称之。细胞悬液细胞悬液（cell suspensioncell suspension）：）：单个细胞分散存在于培养液或者其它平衡盐溶液、缓冲溶单个细胞分散存在于培养液或者其它平衡盐溶液、缓冲溶液中，就称之液中，就称之。几个名词和概念：第2页/共85页当培养物的总体积不断扩大，培养过程持续到一定的时候当培养物的总体积不断扩大，培养过程持续到一定的时候，原先的培养器皿已不能满足培养物的空间要求，这时就需要，原先的培养器皿已不能满足培养物的空间要求，这时就需要将培养物分成若干小的部分，继续培养。将培养物分成若干小的部分，继续培养。因此，按照培养过程中培养物是否需要被
3、分割后再培养，因此，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为而将体外培养分为原代培养原代培养或称或称初代培养初代培养（primary primary cultureculture）和）和继代培养继代培养（secondary culture)secondary culture)或称或称再培养再培养（subculturesubculture）两大类。）两大类。二、体外培养的基本方法和过程几个名词和概念：第3页/共85页（二）继代培养（三）体外培养的基本方法和技术（四）培养物的冻存与复苏（五）培养物的污染（一）原代培养二、体外培养的基本方法和过程第4页/共85页（一）原代培养（p
4、rimary culture）二、体外培养的基本方法和过程原代培养，通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物原代培养，通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。程。原代培养的概念包含以下几方面含义：原代培养的概念包含以下几方面含义：原代培养的实质就是初次培养，即培养物一经接种到培原代培养的实质就是初次培养，即培养物一经接种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养物的生长器养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养物的生长器皿；皿；原代培养中的原代培养中的“代代”并不是指细胞的
5、并不是指细胞的“代代”数，原代培数，原代培养物中的细胞在接种之后并不一定没有分裂增殖。相反，在原养物中的细胞在接种之后并不一定没有分裂增殖。相反，在原代培养过程中，培养物中的细胞也可能经历多次的细胞分裂活代培养过程中，培养物中的细胞也可能经历多次的细胞分裂活动而产生多个子代细胞；动而产生多个子代细胞；第5页/共85页原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿，像盖玻片培养法和悬滴培养法，也不等于不更换培养器皿，像盖玻片培养法和悬滴培养法，即便在换液过程中更换培养器皿，但不更换培养组织细胞所即便在换液过程中更换培养器皿，但不
6、更换培养组织细胞所附着的生长基质盖片，仍属于原代培养；附着的生长基质盖片，仍属于原代培养；植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需要分割培养物为较小的部分再养物增长到一定程度后，也需要分割培养物为较小的部分再培养。培养。二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primary culture）第6页/共85页、取材及培养材料的制备、分离（散）细胞的方法、接种与培养过程、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primary culture）第7页/共85页（1 1）准备工作：（2 2）制备基本步骤（技
7、术路线）：主要是主要是取材器具取材器具、用品用品的的灭菌灭菌以及以及实验者实验者、实验动实验动物物的的清洁与消毒清洁与消毒。、取材及培养材料的制备：二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primary culture）第8页/共85页大块组织洗去血污 剔除多余成分切成约1mm3大小的植块植块培养 将所取组织剪碎 蛋白酶溶液消化 机械方法吹打组织块 不锈钢网筛过滤 过滤液离心 用培养液悬浮成细胞悬液 计数并调节细胞密度 培养分离的细胞二、体外培养的基本方法和过程（2 2）基本步骤（技术路线）：（一）原代培养（primary culture）第9页/共85页、取材及培养材料的制备：二、体外培
8、养的基本方法和过程关于取材：（1)1)取材要准确：取材是体外培养工作的开端。如果在取材要准确：取材是体外培养工作的开端。如果在这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个体外培养过程就很难达到预期的目的。体外培养过程就很难达到预期的目的。(2)(2)关于取材及制备培养材料的步骤：就动物不同组织的关于取材及制备培养材料的步骤：就动物不同组织的取材而言，取材的步骤大同小异。但在具体操作过程中，还取材而言，取材的步骤大同小异。但在具体操作过程中，还需要根据具体的实验情况做一些调整。需要根据具体的实验情况做一些调整。（一）原代培养（prima
9、ry culture）第10页/共85页、取材及培养材料的制备、分离（散）细胞的方法、接种与培养过程、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primary culture）第11页/共85页（1 1）机械解离细胞法：1 1）吸管吹打法-2 2）过筛法-（2 2）酶学解离细胞法：1 1）胰蛋白酶离解细胞法-2 2）胶原酶离解细胞法-（3 3）螯合剂解离细胞法：常用螯合剂：乙二胺四乙酸钠（EDTA-NaEDTA-Na）、柠檬酸钠、枸橼酸钠。二、体外培养的基本方法和过程、分离（散）细胞的方法：（一）原代培养（primary culture）第12页/共85页、取材及培养材料的制备、分
10、离（散）细胞的方法、接种与培养过程、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primary culture）第13页/共85页、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程接种接种（seedingseeding）也称）也称种植种植(plating)(plating)或或体外移植体外移植(explantation),(explantation),实际上就是将取材并切割好的组织块（植块）实际上就是将取材并切割好的组织块（植块）或者分离好的细胞悬液加到培养器皿内的过程。或者分离好的细胞悬液加到培养器皿内的过程。如果将准备好的植块（包括器官型植块）接种并进行培如果将准备好的植块（包括器官型
11、植块）接种并进行培养，就称为养，就称为植块培养植块培养。体外移植体外移植的称谓较多用于植块培养的的称谓较多用于植块培养的情况。情况。如果将所制备的细胞悬液用于种植和培养，就称为如果将所制备的细胞悬液用于种植和培养，就称为分离分离（散）细胞培养（散）细胞培养。（一）原代培养（primary culture）第14页/共85页、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程分离（散）细胞培养的细胞如果属于分离（散）细胞培养的细胞如果属于贴壁依赖型细胞贴壁依赖型细胞，在培养瓶皿中必须黏附于一定的生长基质表面才能生长，这在培养瓶皿中必须黏附于一定的生长基质表面才能生长，这样的细胞一般只能在培养瓶皿表面长满
12、一层，当培养物长满样的细胞一般只能在培养瓶皿表面长满一层，当培养物长满培养器皿的表面时即会因为接触抑制而停止生长，这种培养培养器皿的表面时即会因为接触抑制而停止生长，这种培养方式就称为方式就称为单层细胞培养（单层细胞培养（single-layer cell culture)single-layer cell culture)。如果所培养的细胞没有贴壁依赖性，在悬浮状态下即可如果所培养的细胞没有贴壁依赖性，在悬浮状态下即可以生长和繁殖，这样的培养方式就称为以生长和繁殖，这样的培养方式就称为悬浮（细胞）培养悬浮（细胞）培养（suspension culturesuspension culture）
13、。）。（一）原代培养（primary culture）第15页/共85页、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（1 1）植块培养：）植块培养：植块培养是比较简单的培养方法，其技术要点就是将从植块培养是比较简单的培养方法，其技术要点就是将从动物体内所取得的组织切割成一定大小的植块，再将植块接动物体内所取得的组织切割成一定大小的植块，再将植块接种到培养瓶皿内，加入培养液，然后将培养瓶皿送入培养箱种到培养瓶皿内，加入培养液，然后将培养瓶皿送入培养箱中进行培养。中进行培养。植块培养的目的主要有两个，植块培养的目的主要有两个，其一其一是观察植块的组织学是观察植块的组织学生长行为，生长行为，其二其二
14、是通过植块培养，让构成植块的细胞从植块是通过植块培养，让构成植块的细胞从植块内迁移出来并在植块外分裂增殖，然后将植块去除，从而得内迁移出来并在植块外分裂增殖，然后将植块去除，从而得到细胞培养物。到细胞培养物。（一）原代培养（primary culture）第16页/共85页、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（2 2）分离（散）细胞培养：）分离（散）细胞培养：相对于植块培养法，分离（散）细胞培养的最大优点是：相对于植块培养法，分离（散）细胞培养的最大优点是：解除了植块内细胞之间的解除了植块内细胞之间的“组织关系组织关系”，从而可以反映出单，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。个细胞的生
15、物学特征。借助分离（散）细胞培养法，还可以分离借助分离（散）细胞培养法，还可以分离(isolate)(isolate)或纯或纯化某一类型的细胞，从而实现对化某一类型的细胞，从而实现对单一细胞类型（单一细胞类型（monotypic monotypic cell culturecell culture）进行细胞生物学研究。进行细胞生物学研究。动物组织的大多数细胞类型都属于动物组织的大多数细胞类型都属于贴壁（锚定）依赖型贴壁（锚定）依赖型细胞（细胞（anchorage-dependent cell)anchorage-dependent cell)。（一）原代培养（primary culture）第
16、17页/共85页、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（3 3）生长基质：）生长基质：生长基质（生长基质（growth substratumgrowth substratum）泛指泛指培养物附着的各种介培养物附着的各种介质，质，狭义特指狭义特指在塑料或玻璃培养器皿表面上涂布（包被）的一在塑料或玻璃培养器皿表面上涂布（包被）的一层能够促进培养物黏附、贴壁与铺展的生物活性物质。层能够促进培养物黏附、贴壁与铺展的生物活性物质。一般来说，国际上一些著名厂商生产的塑料或玻璃培养器一般来说，国际上一些著名厂商生产的塑料或玻璃培养器皿，其使用的材质能够适宜大多数种类的动物细胞体外生长。皿，其使用的材质
17、能够适宜大多数种类的动物细胞体外生长。只有少数黏附和贴壁能力较差的细胞，需给予提供包被有特殊只有少数黏附和贴壁能力较差的细胞，需给予提供包被有特殊生长基质物质的生长表面。生长基质物质的生长表面。（一）原代培养（primary culture）第18页/共85页、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程（4 4）悬浮细胞培养（）悬浮细胞培养（suspension cell culture）对于有些细胞来说，其生长不需要黏附在某一固相表面便对于有些细胞来说，其生长不需要黏附在某一固相表面便能分裂增殖。例如，某些白血病细胞、某些腹水瘤细胞等。能分裂增殖。例如，某些白血病细胞、某些腹水瘤细胞等。体外
18、培养这种细胞时，可以通过对培养液以及其中的细胞体外培养这种细胞时，可以通过对培养液以及其中的细胞进行不断搅拌，或对培养器皿进行振荡、快速旋转而维持细胞进行不断搅拌，或对培养器皿进行振荡、快速旋转而维持细胞的悬浮状态。也有一些细胞无须搅拌或用摇床摇动，只要在培的悬浮状态。也有一些细胞无须搅拌或用摇床摇动，只要在培养器皿表面涂布一层不利于细胞粘附的硅脂即可维持悬浮状态。养器皿表面涂布一层不利于细胞粘附的硅脂即可维持悬浮状态。这种培养方法就称为这种培养方法就称为悬浮细胞培养悬浮细胞培养。（一）原代培养（primary culture）第19页/共85页、取材及培养材料的制备、分离（散）细胞的方法、接
19、种与培养过程、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primary culture）第20页/共85页、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程随着培养的进程，营养物被消耗，细胞的代谢产物愈来随着培养的进程，营养物被消耗，细胞的代谢产物愈来愈多，尤其是细胞呼吸反应，释放出的愈多，尤其是细胞呼吸反应，释放出的COCO2 2及其它酸性代谢产及其它酸性代谢产物（如乳酸和丙酮酸）越来越多，培养液的物（如乳酸和丙酮酸）越来越多，培养液的p pH H值越来越低，值越来越低，培养液的颜色越来越黄。培养液的颜色越来越黄。根据培养液的根据培养液的颜色变化颜色变化确定换液的间隔时间是很有确定换液的间
20、隔时间是很有实际实际意义意义的。营养物质消耗的快慢还取决于所接种的细胞数量。的。营养物质消耗的快慢还取决于所接种的细胞数量。随着培养过程的继续，细胞会分裂增生，数量增加，换随着培养过程的继续，细胞会分裂增生，数量增加，换液的时间间隔就可能越来越短。液的时间间隔就可能越来越短。（一）原代培养（primary culture）第21页/共85页二、体外培养的基本方法和过程5 5、原代细胞培养方法的注意事项（1 1）关于培养液：）关于培养液：1)1)培养基的选择：培养基的选择：培养某一种细胞，到底选用哪一种培养基，需要培养某一种细胞，到底选用哪一种培养基，需要根据细胞的生长情况摸索确定。根据细胞的生
21、长情况摸索确定。2 2）添加物：添加物：选择好培养基类型以后，还要摸索需要补加的成分及选择好培养基类型以后，还要摸索需要补加的成分及其添加量。其添加量。3)3)培养液的酸碱度：培养液的酸碱度：普通动物细胞一般适宜的普通动物细胞一般适宜的p pH H范围为范围为7.27.27.47.4当当p pH H值低于值低于6.86.8时，会对细胞的生长产生抑制作用。时，会对细胞的生长产生抑制作用。4)4)换液：换液：换液时，如果细胞密度很低或者细胞的生长较为缓慢，可换液时，如果细胞密度很低或者细胞的生长较为缓慢，可以不完全更换培养液，只吸出一半的旧培养液，补加相同体积的以不完全更换培养液，只吸出一半的旧培
22、养液，补加相同体积的新培养液即可。新培养液即可。培养液最好经事先预温至培养液最好经事先预温至37370 0C C。（一）原代培养（primary culture）第22页/共85页二、体外培养的基本方法和过程5 5、原代细胞培养方法的注意事项（2 2）关于培养空间：培养空间是指培养物生存的空间，包括液相环境与气相环境两方面。调整培养空间的主要目的是改变对培养物的供氧量。一般来说，培养液与液面上的空间二者之间的体积比例以1 1：1010为宜。加入的培养液液面高度最好维持在2 25mm5mm的范围。（一）原代培养（primary culture）第23页/共85页二、体外培养的基本方法和过程5 5
23、、原代细胞培养方法的注意事项（3 3）其它方面：必须根据不同细胞生命力的不同以及对环境转变适应能力的不同，选择适宜的取材、分散、种植方法和选用适当的培养条件。除了所培养细胞自身的活力外，原代培养不成功最大的可能性有两点：其一是在对组织分散并分离细胞的过程中严重损伤了细胞，其二是给细胞提供的体外生长环境，尤其是生长基质与培养液条件不合适。（一）原代培养（primary culture）第24页/共85页（二）继代培养（三）体外培养的基本方法和技术（四）培养物的冻存与复苏（五）培养物的污染（一）原代培养二、体外培养的基本方法和过程第25页/共85页（二）继代培养（secondary culture
24、）二、体外培养的基本方法和过程将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为，再进行培养，这个过程就称为传代（传代（passagepassage）或者或者再培养再培养（subculturesubculture）。）。传代培养的实质就是传代培养的实质就是分割后再次培养分割后再次培养。只要是将培养物从一个培养器皿转移到另一个器皿之内继只要是将培养物从一个培养器皿转移到另一个器皿之内继续培养就算续培养就算传代传代。即便是按。即便是按“一传一一传一”的比例进行传代。的比例进行传代。第26页/共85页1 1、原代培养物需要
25、传代的指标2 2、传代的过程3 3、传代培养的注意事项二、体外培养的基本方法和过程（二）继代培养（secondary culture）第27页/共85页二、体外培养的基本方法和过程（1 1）植块培养物与器官培养物：）植块培养物与器官培养物：植块培养物生长一定时间之后，从植块内长出植块培养物生长一定时间之后，从植块内长出（outgrowingoutgrowing）的细胞会越来越多，迁移出来的细胞也会不断）的细胞会越来越多，迁移出来的细胞也会不断分裂繁殖，逐渐长满所附着的生长基质表面，细胞之间逐渐发分裂繁殖，逐渐长满所附着的生长基质表面，细胞之间逐渐发生接触性抑制现象。生接触性抑制现象。若不将原代
26、培养物分割再进行培养，植块培养物可能会停若不将原代培养物分割再进行培养，植块培养物可能会停止生长。止生长。1 1、原代培养物需要传代的指标（二）继代培养（secondary culture）第28页/共85页二、体外培养的基本方法和过程（2 2）分离（散）细胞培养物：）分离（散）细胞培养物：对于贴壁依赖型细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞对于贴壁依赖型细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞分裂增殖，数量愈来愈大，逐渐会在培养瓶皿的底壁形成一分裂增殖，数量愈来愈大，逐渐会在培养瓶皿的底壁形成一完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此时便
27、需要进行传代。时便需要进行传代。判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的主要指标主要指标就就是观察培养物是观察培养物是否已基本长满培养瓶皿的底壁是否已基本长满培养瓶皿的底壁。1 1、原代培养物需要传代的指标（二）继代培养（secondary culture）第29页/共85页二、体外培养的基本方法和过程（3 3）悬浮培养物：）悬浮培养物：悬浮培养细胞之间虽然不容易发生接触性抑制现象，但悬浮培养细胞之间虽然不容易发生接触性抑制现象，但随着培养液中细胞数量的增加，细胞的生存空间会越来越小，随着培养液中细胞数量的增加，细胞的生存空间会越来越小，营养供应愈趋紧张，代
28、谢产物积聚，培养环境逐渐不适应细营养供应愈趋紧张，代谢产物积聚，培养环境逐渐不适应细胞的生长，因而需要传代。胞的生长，因而需要传代。1 1、原代培养物需要传代的指标（二）继代培养（secondary culture）第30页/共85页1 1、原代培养物需要传代的指标2 2、传代的过程3 3、传代培养的注意事项二、体外培养的基本方法和过程（二）继代培养（secondary culture）第31页/共85页二、体外培养的基本方法和过程2 2、传代的过程（1 1）分离（散）细胞培养物 ：（贴壁依赖型细胞）1 1）弃去原培养液（吸出或倾倒）；2 2）漂洗：1212次，3 3）离解细胞：4 4）终止消
29、化：5 5）吹打分离细胞：6 6）离心：7 7）重新悬浮、计数：8 8）分装：9 9）送培养箱继续培养。（二）继代培养（secondary culture）第32页/共85页（2 2）悬浮培养物：无需分割培养物。1 1）离心：2 2）重新悬浮、计数：3 3）分装：4 4）送培养箱继续培养。二、体外培养的基本方法和过程2 2、传代的过程（二）继代培养（secondary culture）第33页/共85页二、体外培养的基本方法和过程2 2、传代的过程（3 3）植块培养物：对这种培养物，仅在少数情况下再培养。对这种培养物，仅在少数情况下再培养。由于它们一般是种植在生长基质盖玻片上，再培养时一由于它
30、们一般是种植在生长基质盖玻片上，再培养时一般不更换生长基质盖玻片，只是将培养物分割并舍弃部分培般不更换生长基质盖玻片，只是将培养物分割并舍弃部分培养物，而将剩余的培养物继续培养养物，而将剩余的培养物继续培养（二）继代培养（secondary culture）第34页/共85页1 1、原代培养物需要传代的指标2 2、传代的过程3 3、传代培养的注意事项二、体外培养的基本方法和过程（二）继代培养（secondary culture）第35页/共85页二、体外培养的基本方法和过程3 3、传代培养的注意事项传代培养首先必须注意的事项：传代培养首先必须注意的事项：根据不同细胞的承受能力；根据不同细胞的承
31、受能力；选择合适的时间；选择合适的时间；采用适当的方法。采用适当的方法。（二）继代培养（secondary culture）第36页/共85页二、体外培养的基本方法和过程3 3、传代培养的注意事项（1 1）传代的时机与再培养的细胞密度：）传代的时机与再培养的细胞密度：不要急于传代是对大多数生命力较为脆弱的细胞体外培养不要急于传代是对大多数生命力较为脆弱的细胞体外培养的的上策上策。除非需要利用传代实现其它的目的，如通过传代对培养物除非需要利用传代实现其它的目的，如通过传代对培养物中的混合细胞进行分离。中的混合细胞进行分离。由于在体时细胞之间的相互作用有利于细胞的生存和生命由于在体时细胞之间的相互
32、作用有利于细胞的生存和生命活动，因而在进行体外分离细胞培养时尽量给细胞提供相互作活动，因而在进行体外分离细胞培养时尽量给细胞提供相互作用的条件。一个重要的方法就是增大接种的细胞密度，使培养用的条件。一个重要的方法就是增大接种的细胞密度，使培养的细胞尽快发生相互作用。的细胞尽快发生相互作用。（二）继代培养（secondary culture）第37页/共85页二、体外培养的基本方法和过程3 3、传代培养的注意事项（2 2）传代数或代数与培养物的生长：）传代数或代数与培养物的生长：传代数或代数（传代数或代数（passage numberpassage number）是指对培养物传代的次）是指对培养
33、物传代的次数。用它可以相对地衡量某一培养物的数。用它可以相对地衡量某一培养物的培养年龄培养年龄（culture culture ageage）。）。经过一次传代，细胞的生长环境就发生一次大的变化。体经过一次传代，细胞的生长环境就发生一次大的变化。体外生长的细胞若处于外生长的细胞若处于“动荡动荡”的生活环境中，其生物学性状往的生活环境中，其生物学性状往往容易发生改变，尤其是细胞的遗传特性可能会发生改变。往容易发生改变，尤其是细胞的遗传特性可能会发生改变。应该认识到，传代对细胞生长和性状是有影响的，在必要应该认识到，传代对细胞生长和性状是有影响的，在必要性不强的情况下，少传代为上。性不强的情况下，
34、少传代为上。（二）继代培养（secondary culture）第38页/共85页（二）继代培养（三）体外培养的基本方法和技术（四）培养物的冻存与复苏（五）培养物的污染（一）原代培养二、体外培养的基本方法和过程第39页/共85页二、体外培养的基本方法和过程（三）体外培养的基本方法和技术这里要介绍的是，体外培养这门技术从这里要介绍的是，体外培养这门技术从创立以来所发展起来的、若干种被普遍运用创立以来所发展起来的、若干种被普遍运用的、具有代表性的基本方法和技术。的、具有代表性的基本方法和技术。这些基本的方法和技术有的还在使用，这些基本的方法和技术有的还在使用，有的则已不常使用，代之以一些改良的方法
35、有的则已不常使用，代之以一些改良的方法和技术。和技术。第40页/共85页二、体外培养的基本方法和过程（三）体外培养的基本方法和技术1 1、悬滴培养法2 2、培养瓶培养法3 3、盖玻片培养法4 4、旋转管培养法5 5、灌注小室培养法6 6、培养板培养法7 7、二倍体细胞培养法8 8、克隆培养法9 9、中空纤维细胞培养技术1010、微载体细胞培养法1111、微囊培养技术第41页/共85页2 2、培养瓶（culture flaskculture flask）培养法凡是可以用于培养生物结构成分的瓶子都可凡是可以用于培养生物结构成分的瓶子都可以叫做以叫做培养瓶培养瓶。早期的培养瓶主要是早期的培养瓶主要是
36、玻璃玻璃培养瓶，如今国外培养瓶，如今国外主要用一次性使用的主要用一次性使用的塑料塑料培养瓶。培养瓶。卡氏瓶（carlsbergs flask）北京瓶 塑料培养瓶 所谓所谓培养瓶培养法培养瓶培养法，就是将拟培养对象直接接，就是将拟培养对象直接接种在培养瓶内，再放入培养箱进行培养的方法。这种在培养瓶内，再放入培养箱进行培养的方法。这种培养法只是强调所用的培养器皿是培养瓶而已。种培养法只是强调所用的培养器皿是培养瓶而已。第42页/共85页卡氏瓶北京瓶经典的培养瓶第43页/共85页6 6、培养板培养法培养板培养法培养板培养法过去曾被称为过去曾被称为微量培养法微量培养法（microculturemicr
37、oculture）：是现代体外培养技术中最为普遍应用的常规培养方法之一。是现代体外培养技术中最为普遍应用的常规培养方法之一。它是将所培养的细胞接种在培养板的孔内，然后在它是将所培养的细胞接种在培养板的孔内，然后在COCO2 2培养箱中进培养箱中进行培养的一种培养方法。行培养的一种培养方法。培养板的应用使得细胞培养技术规范化、标准化，使得细培养板的应用使得细胞培养技术规范化、标准化，使得细胞培养可以微量培养的方式进行，使得科研工作者能够对培养胞培养可以微量培养的方式进行，使得科研工作者能够对培养物进行规范的、定量的组间比较。物进行规范的、定量的组间比较。培养板一般都是一次性使用的培养器皿，有极为
38、规范的商培养板一般都是一次性使用的培养器皿，有极为规范的商品供应。品供应。第44页/共85页8 8、克隆培养法（cloning culture techniquecloning culture technique）克隆（克隆（cloneclone）一词既有名词意义又有动词含义。一词既有名词意义又有动词含义。作名词讲时，意指由同一个祖细胞分裂增生而来的一个作名词讲时，意指由同一个祖细胞分裂增生而来的一个子细胞群，体外培养技术中常用的细胞克隆（子细胞群，体外培养技术中常用的细胞克隆（cell clonecell clone或或colonycolony）即为此意。即为此意。作动词解时，克隆一词主要指
39、从同一个祖细胞经分裂增作动词解时，克隆一词主要指从同一个祖细胞经分裂增殖而产生一个子细胞群的过程，体外培养技术中的细胞克隆殖而产生一个子细胞群的过程，体外培养技术中的细胞克隆（cell cloningcell cloning）就是这个意思。就是这个意思。克隆培养法也可以称作克隆培养法也可以称作单细胞分离培养法单细胞分离培养法（single cell single cell cultureculture），），就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之分裂增殖而产生一个细胞群的培养方法。使之分裂增殖而产生一个细胞群的培养方法。第45页/共85页克隆培
40、养法克隆培养法最基本的要求是最基本的要求是拟用于培养并分裂增殖的祖细拟用于培养并分裂增殖的祖细胞必须是一个细胞，如此才能获得具有同一祖先的子细胞群。胞必须是一个细胞，如此才能获得具有同一祖先的子细胞群。理论上讲，各种生物体细胞都可以进行克隆培养，但由于理论上讲，各种生物体细胞都可以进行克隆培养，但由于细胞在体外培养时生长繁殖的环境、生命力等方面均不如在体细胞在体外培养时生长繁殖的环境、生命力等方面均不如在体时的情况。所以，时的情况。所以，能够进行克隆培养的细胞一般只是一些细胞能够进行克隆培养的细胞一般只是一些细胞活力强、增殖能力强、对体外生长环境适应性强的细胞，如肿活力强、增殖能力强、对体外生
41、长环境适应性强的细胞，如肿瘤细胞和转化（无限）细胞系、（胚胎）干细胞以及微生物细瘤细胞和转化（无限）细胞系、（胚胎）干细胞以及微生物细胞等。这些细胞种类即便是单个细胞被置于体外培养环境，也胞等。这些细胞种类即便是单个细胞被置于体外培养环境，也可以逐渐适应培养环境并行分裂增殖，从而形成一群子细胞。可以逐渐适应培养环境并行分裂增殖，从而形成一群子细胞。8 8、克隆培养法（cloning culture techniquecloning culture technique）第46页/共85页实验课时间：第实验课时间：第7 9周周实验课地点：实验课地点：104馆四楼馆四楼注意事项：注意事项：1.1.网
42、上没有名字的网上没有名字的 同学同学请不要填报实请不要填报实 验课名单。验课名单。2.2.现在不能确定现在不能确定 自己时间的同学自己时间的同学 不要填报，可以不要填报，可以 下次上课时再报。下次上课时再报。3.3.一旦填报就不能一旦填报就不能 再更改时间。再更改时间。第47页/共85页（二）继代培养（三）体外培养的基本方法和技术（四）培养物的冻存与复苏（五）培养物的污染（一）原代培养二、体外培养的基本方法和过程第48页/共85页（四）培养物的冻存与复苏二、体外培养的基本方法和过程在体外培养工作中，为了保种和长期保存培养物的活性，在体外培养工作中，为了保种和长期保存培养物的活性，常须将培养物进
43、行冷冻保存，并在需要的时候重新复苏和培养。常须将培养物进行冷冻保存，并在需要的时候重新复苏和培养。、培养物的冷冻保存与复苏原理冷冻保存冷冻保存（cryopreservation）：）：就是将体外培养物悬就是将体外培养物悬 浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的 冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70-70 的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的 过程。过程。复苏复苏（thawing）：）：就是以一定的复温速率将冻存的培养物就是以一定的复温速率将冻存的培养物 恢复到
44、常温的过程。恢复到常温的过程。第49页/共85页细胞内的冰晶损伤（intracellular ice-damage）：是指因细胞内部结冰而致的细胞损伤。纯水（细胞悬浮其中）低于零度 结冰 细胞内外的水分都会结冰 冰晶造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡、培养物的冷冻保存与复苏原理第50页/共85页溶质损伤（solute damagesolute damage）或称溶液损伤（solution damagesolution damage）是指因保存细胞的溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤。溶液（细胞悬浮其中）温度下降 细胞外的水分先结冰 在复温时，大量水分就会渗入细胞内，造成细胞死亡 未结冰的溶液中
45、电解质浓度升高 细胞在高溶质的溶液中时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便会发生渗漏。、培养物的冷冻保存与复苏原理第51页/共85页在溶液中加入冷冻保护剂在溶液中加入冷冻保护剂(cryoprotectant)时，则可保护细时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，因为冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度，降低未结冰溶液中电减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度，降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低
46、温条件下保存。下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，在复苏时，一般以很快的速度升温，1 12 2 minmin内恢复到常内恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而不会产生冰晶损伤和溶质损伤，溶质的溶液中过长时间，从而不会产生冰晶损伤和溶质损伤，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。度和复温速率有关。、培养物的冷冻保存与复苏原理
47、第52页/共85页（）冷冻速率细胞在冷冻过程中会发生如下生理变化细胞在冷冻过程中会发生如下生理变化：*当细胞被冷至当细胞被冷至-5-5左右时，因溶液中加有冷冻保左右时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低了溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；护剂而降低了溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；*当细胞被冷至当细胞被冷至-5-5-1515之间时，细胞外溶液之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能，其结果是：细胞内水分为了和细胞外水分保的
48、化学能，其结果是：细胞内水分为了和细胞外水分保持化学能的平衡，会向细胞外流动持化学能的平衡，会向细胞外流动。是指降温的速度。、培养物的冷冻保存与复苏原理第53页/共85页冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况就会不同：就会不同：（1 1）冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱）冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；结冰；（2 2）冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间）冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；外渗，结果随
49、着温度的下降而发生细胞内结冰；（3 3）冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细）冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。璃化冷冻）。、培养物的冷冻保存与复苏原理（）冷冻速率第54页/共85页超快速玻璃化冷冻：是细胞存活最理想的冷冻方法。因为细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中暴露时间过长而受损。不同细胞的最适冷冻速率不同。所以，在对一种细胞进行冷冻保存之前，首先要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高冷冻存活率。、培养物的冷冻保存
50、与复苏原理（）冷冻速率第55页/共85页（）冷冻保存温度是指能长久保存细胞的超低温度。在超低温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，经过长期保存在复苏后仍能保持正常的结构和功能。液氮温度（-196-196）是目前最佳冷冻保存温度。在-196-196时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能保持完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196-196均可保存十年以上。应用-70-70-8080条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。、培养物的冷冻保存与复苏原理第56页/共85页（）复温速率 是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细