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1、生长：生长：原生质与细胞组分的增加；原生质与细胞组分的增加；繁殖：繁殖：菌体细胞数量的增加。菌体细胞数量的增加。微生物的生长伴随体积增大和细胞分裂，所以，生长的概念中包含着繁殖。第1页/共67页第一节第一节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法测定细胞干重法 单位体积培养物中细胞物质的干重（一）直接法第2页/共67页（二）间接法比浊法生长指标法含氮量测定法 微生物细胞中蛋白质的含量是比较稳定的，测出微生物细胞中的含N量后再换算出蛋白质的含量，可用凯氏定N法。蛋白质的含量=氮量6.25DNA含量的测定ATP含量的测定代谢活性法第3页/共67页二、计繁殖数法（一）直接法 血球计数板第4页/共67页
2、平板菌落计数法平板菌落计数法简单易行，但易造成机械损伤（二）间接法第5页/共67页一一、微生物个体生长和同步生长同步培养法：能获得处于同一生长阶段 的群体细胞的培养方法同步生长：运用同步培养技术，控制微 生物生长，使之处于同一生长 阶段并同时分裂。第二节 微生物的生长规律第6页/共67页获得同步生长的方法：获得同步生长的方法：1.机械法机械法 收集同样大小的细胞 密度梯度离心：选择性滤膜法:2.调整生理条件法：温度、光、限制因子等 例：温度开始很低，使其均处在 仅活着的状态升高温度 同步生长.抑制生长法：加入代谢抑制剂，阻遏DNA DNA 复制解阻遏同步第7页/共67页生长曲线：生长曲线：将少
3、量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样，测菌量。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。二二、单细胞的典型生长曲线第8页/共67页（1 1）延滞期（）延滞期（lag phaselag phase）1.现象：活菌数没增加，曲线平 行于横轴。2.原因：由于细胞进入新环境,细胞数目无增长，甚至有所下 降有一个适应过程，进行大量 的酶（诱导酶）的生成。3.细胞特点:细胞的新陈代谢非 常旺盛，个体体积显著增大，为细胞分裂作准备。第9页/共67页4.4.此期长短：此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培 养条件有关。5.意义：在实际工作中，
4、缩短lag phase lag phase 的措施：1 1）加大接种量（群体优势-适应性增强）2 2）选用对数期的种子（此时细胞分裂旺盛）3 3）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的成分 4 4）选用繁殖快的菌种第10页/共67页（2 2）指数期）指数期(exponential phase)(exponential phase)1.现 象：细 胞 数 目 以 几 何 级 数增加，其对数与时间 呈直线关系。2.细胞特点：此时细胞的 大小、组成、生理特征等 均趋于一致，代谢活跃，生长速率高，代时稳定。第11页/共67页代时（世代时间代时（世代时间eneration time,G）：）：单个细
5、胞完成一次分裂所需要的时间意义：（）代谢、生理研究的好材料 （）生产中用其作种G=t/n=t2 t13.3(lgx2lgx1)（）与菌种有关；（）受培养条件(温度、营养成分、营养物浓度）的制约；同一菌种在不同培养条件下代时不同第12页/共67页(3)(3)稳定期（稳定期（stationary phase):stationary phase):2.特 点:细 胞 的 菌 体 形 态 典 型，芽孢形成，细胞内开始 贮藏物质。1.现象：活菌数目不增不 减，生长速率趋于0,0,曲 线有一下降的趋势。第13页/共67页3.出现原因：出现原因：4.意义：1 1）营养物质大量消耗；2 2）有毒代谢产物大量积
6、累；3)3)营养物比例失调4 4）外界条件影响（pHpH、高细胞浓度，氧化还原电位等）1 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pHpH 调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。第14页/共67页3）生长产量常数：概念：概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度 根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5Y=0.5，表示要得到5g5g菌体，需某营养物（葡萄 糖）10g10g。第15页/共67页（4 4）衰亡期）衰亡期1.现象：细胞死亡速率大于生长速率。一般总菌数不变,活菌数
7、曲线下降。2.特 点：菌 体 变 形，大 小 不一，细胞出现自溶,生理代 谢活动停滞。第16页/共67页三、微生物的连续培三、微生物的连续培养养 第17页/共67页单（分）批培养：指微生物在一定容积的培养基中，在特定培养条件下只完成一个生长循环（最后一次收获）的培养方法。（封闭系统）连续培养：指微生物在整个生长时间，以一定的方法（恒浊、恒化）使微生物持续的以较恒定的生长速率生长的培养方法。（开放系统）第18页/共67页（一）按控制方式分（一）按控制方式分1.1.恒浊培养恒浊培养概念：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：维持菌浓度不变。特点：基质过量，菌以最
8、高速率生长；但工艺复杂，烦琐。以获得菌体或与菌体生长相平行的代谢产物第19页/共67页2.2.恒化培养恒化培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：恒化器中动态平衡的稳定性，是以某种生长限制因子（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度来控制菌的生长速度。特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生长速率。主要用于科学研究第20页/共67页(二)按培养器级数分1.单级连续培养微生物代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平行2.多级连续培养微生物代谢产物不与菌体生长速率相平行第21页/共67页连续培养的优点连续培养的优点1 1、缩短发酵周期，提高设备的利用率；2 2、便于自
9、控。降低动力消耗及劳动强度；3 3、产品均一；4 4、节约资源连续培养的缺点易杂菌污染；菌种易退化;营养物利用率低第22页/共67页四、微生物的高密度培养High cell-density culture,HCDC一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术特点（1）产品产值高 （2）提高下游工程的效率 （3）生产成本相对降低第23页/共67页HCDC中注意的问题选取最佳培养基成分和各成分含量补料：逐量流加提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成第24页/共67页影响微生物生长的影响微生物生长的主要因素主要因素 第三节第25页/共67页一、温度一、温度 最高生
10、长温度：微生物生长的最高温度；最适生长温度：微生物生长最快时的温度1 1）最适生长温度不等于积累代谢产物的最佳温度；2 2）同类型发酵使用菌种不同，最适生长温度不同；3 3）同一微生物不同生理活动的最适生长温度不同。（一）三种基本温度（生长温度三基点）最低生长温度：微生物生长的最低温度下限；第26页/共67页（二）按最适生长温度将微生物分类：（二）按最适生长温度将微生物分类：低温微生物（20）中温微生物（2045)高温微生物（45）第27页/共67页1、低温微生物：、低温微生物：生长机理：生长机理：细胞内的酶促反应在低温下进行，温 度高（30-40），酶失活。胞膜中不饱和脂肪酸的含量高，故低
11、温下膜的流动性较好。2、中温微生物：、中温微生物：大多数微生物属此类（20-45）第28页/共67页3、高温微生物：、高温微生物：生长机理：生长机理：1)细胞内酶、蛋白质抗热性强，热稳定性好 酶促反应可在高温下进行。2)菌体内产多胺、热亚胺及高温精胺，可稳 定细胞内蛋白质合成机构及保护大分子。3)膜中饱和脂肪酸和直链脂肪酸含量高，易 形成疏水键，高温下仍能保持膜稳定及结构 功能。第29页/共67页4、最适生长温度与最适发酵温度微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度=发酵速度快、积累代谢产物多。如：柠檬酸生产菌黑曲霉2087，32-31生长快，而32 产酸多。工业上：1）同类型发酵，
12、使用菌种不同，T不同：如：德氏乳酸杆菌：45-50；保加利亚乳酸杆菌：45；2）发酵前后期温度不同：如：酒精发酵：前期：28；后期：33-35。第30页/共67页 根据微生物所适应的最适生长温度通常把微生物分为高温型、中温型和低温型 第31页/共67页（三）温度对微生物生长的影响（三）温度对微生物生长的影响 1)影响胞内酶活，进而影响细胞物质的合成，影响微生物生长速率。2)影响胞膜的流动性，从而影响物质的吸收、分泌，进而影响微生物生长。低温：冰晶形成造成膜损伤、细胞脱水；高温：蛋白质不可逆变性，膜受热出现小 孔，破坏细胞结构（溶菌）。第32页/共67页二、氧二、氧(一）氧在体内易转变为超氧阴离
13、子自由基：1、形成：为非酶促方式：O2 +e O22、特点：既有分子性质，又有离子性质；反应力极强，性质极不稳定；可破坏膜和重要生物大分子，亦可产生 其它毒性的活性氧化物。第33页/共67页（二）O2驱除机制：1、SOD（超氧化物歧化酶）的作用；2、过氧化氢酶的作用好氧菌和耐氧菌；O2 +2H+H2O2 H2O +（1/2O2）12第34页/共67页 好氧菌、微好氧菌、兼性厌氧菌、厌氧菌、耐氧菌。（三）根据微生物对氧需求量的不同分为：第35页/共67页各类菌所含对氧解毒酶专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶兼性厌氧菌 SOD，过氧化氢酶专性厌氧菌 二种酶均无微好氧菌 少量SOD耐氧菌 SOD，过氧化
14、物酶第36页/共67页 几乎所有的微生物在pH4.09.0之间都可以生长，但不同的微生物都有其最适的生长pH值范围细菌、藻类、原生动物最适pH6.57.5，但pH4.010.0也可以生长，特殊的硫化菌在pH1.2.0下生长，硝化菌在pH11生长放线菌最适pH7.58.0，pH5.010也可生长霉菌、酵母最适pH5.06.0，pH1.510都可生长三、氢离子浓度（三、氢离子浓度（pH）第37页/共67页第四节 微生物培养法概论第38页/共67页一、实验室培养法（一）固体培养法1.1.好氧菌的固体培养 试管斜面、培养皿琼脂平板克氏扁瓶、茄子瓶第39页/共67页1.固体培养基 (1)平板培养菌落：单
15、个细胞在固体培养基表面经过培养形成肉眼可见的微生物集团。第40页/共67页(2)斜面培养菌苔：微生物密集生长所形成的。其作用是可用来保存菌种。第41页/共67页2.厌氧菌的固体培养（1）高层琼脂柱 如韦荣氏管（2）厌氧培养皿（3）亨盖特滚管技术（4）厌氧罐技术（5）厌氧手套箱无氧培养基（一般加刃天青）第42页/共67页1.好氧菌的液体培养 有微生物生长的培养基是浑浊的。可分为表面生长（好氧）和沉淀生长（厌氧或菌体自重）（二）液体培养法第43页/共67页培养方法：（1）试管液体培养（2）三解瓶浅层培养（3）摇瓶培养（4）台式发酵罐（二）厌氧菌的液体培养（1）培养基中加入还原剂（2）杜绝空气与培养
16、接触第44页/共67页二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法1.好氧菌的曲法培养将麦麸碎麦或豆饼等基质经蒸煮和自然接种后，薄薄地铺在培养容器表面，使微生物既可获得充足的氧气，又利于散热，还可利于产孢子分类：瓶，袋，盘，帘子，转鼓和通风第45页/共67页2.厌氧菌的堆积培养法白酒生产已酸生产（二）液体培养法1.好氧菌的培养(1)浅盘培养(2)深层液体通气培养第46页/共67页第五节 有害微生物的控制一、几个基本概念第47页/共67页（一）灭菌sterilization 杀菌和溶菌第48页/共67页（二）消毒disinfection（三）防腐antisepsis制菌低温；缺氧；干燥；高渗；
17、高酸度；高醇度；加防腐剂（四）化疗 选择具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对其寄主基本无毒的化学物质来抑制寄主体内病原微生物的生长繁殖第49页/共67页干燥干燥 干燥时，微生物代谢立即停止、死亡。机理：细胞内蛋白质变性、盐类浓缩。影响干燥致死的因素：1 1、微生物种类：有芽孢、荚膜、孢子的菌对干燥 有抗性，TBTB、链球菌孢子的菌对干燥有抗性。2 2、环境：微生物表面附着的有机物。3 3、温度、光、湿度。应用：食品保存、菌种保藏。第50页/共67页渗透压渗透压v高渗（20%NaCl）：质壁分离v低渗（5%）:细胞破裂v等渗:生理盐水v应用：一般菌耐受 5%NaCl；耐高渗菌、嗜盐菌 15%
18、NaCl；一般 NaCl 2020%或糖30%以上可抑菌。第51页/共67页二、物理灭菌因素的代表高温（一）高温灭菌的种类1.干热灭菌法2.湿热灭菌法常压法：巴氏消毒法、煮沸消毒法、间歇灭菌法加压法：加压蒸汽灭菌法、连续加压蒸汽灭菌法第52页/共67页（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素灭菌物体含菌量灭菌锅内空气排除程度灭菌对象pH灭菌对象的体积加热与散热速度第53页/共67页（三）高温对培养基成分的有害影响及防止1.有害影响2.防止法（1）特殊加热灭菌法分开灭菌；Ca2+、Fe3+等与磷酸盐灭菌低压灭菌；连续加压蒸汽灭菌（2）过滤除菌法（3）其他方法第54页/共67页三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗
19、剂最低抑制浓度：在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度半致死剂量：在一定条件下，某化学药剂能杀死50%试验动物的剂量最低致死剂量：在一定条件下，某化学药物能引起试验动物群体100%死亡率的最低剂量第55页/共67页（一）表面消毒剂（二）抗代谢药物的代表磺胺类药物抗代谢药物：指在一类化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。（三）抗生素指一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其他人工衍生物第56页/共67页（二）抗代谢药物（二）抗代谢药物1、作用方式(条件)：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争性拮抗作用（与相应酶竞争性结合）。只有当正常代
20、谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才有用。2、种类：磺胺药叶酸；6-巯基嘌呤嘌呤；5-甲基色氨酸氨基酸；异烟肼吡哆醇。3、磺胺药作用机理：磺胺可阻止叶酸的合成。由于磺胺与细菌生长所必须的对氨基苯甲酸（PABA）的结构非常相似，在一定条件下它们竟争性的与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了PABA进入叶酸分子中，从而阻止了叶酸的合成。人类不需要自身合成叶酸，故磺胺对人无毒 第57页/共67页（三）（三）抗生抗生素素1、概念：1）抗生素：生物在其生命过程中产生的一种次生代谢 产物或其衍生物，在低浓度下抑制或影响其 他生物的生命活动。2）抗菌谱：抗生素是作用对象有一定范围，将这一范 围称该抗生素的抗菌谱。
21、广谱：对多种微生物有作用；窄谱：仅对某一类微生物有作用。第58页/共67页2、抗生素作用机理：1）对细胞壁形成有抑制作用；（如：PN）2）影响细胞膜功能；（如：多肽类抗生素）3）抑制蛋白质合成；（如：红霉素、链霉素）4）干扰核酸代谢；（如：丝裂霉素、灰黄霉素）第59页/共67页A抑制细胞壁的形成：青霉素抑制细菌是因为其结构中的内酰胺结构与胞壁酸中短肽末端的D丙a结构很相似，能占据D丙氨酸的位置与转肽E结合，将E灭活，使侧肽链无法连接，因而抑制了细胞壁的合成第60页/共67页 多粘菌素，短杆菌肽是多肽类抗菌素，它们引起细菌细胞膜损伤，导致细胞质外漏，致使菌体死亡。制霉菌素、两性霉素是多烯类抗生素
22、，它们能与真菌细胞膜中的固醇结合，从而破坏膜结构，使细胞物质外漏，使真菌菌体死亡，但对细菌无效（因其壁中无固醇）B.影响细胞膜的功能第61页/共67页 C.干扰蛋白质合成 卡那霉素、链霉素、春霉霉素作用于蛋白质合成场所核糖体的30S亚基；氯霉素、红霉素、林可霉素等，则作用于核糖体50S亚基，抑制了核糖体的活性。第62页/共67页 D.阻碍核酸的合成 与核酸的碱基结合，形成交叉连接的复合体阻碍双链DNA解链，从而影响了DNA的复制，如丝裂霉素切断DNA链，降低其分子量，干扰DNA的复制，如博莱霉素（争光霉素）。作用于核酸E，导致E活性降低或丧失，如利福霉素与RNA合成酶结合，抑制RNA合成E的起
23、始过程。放线菌素D（更生霉素）：干扰RNA聚合酶的转录过程。有的抗生素可嵌入到DNA分子上，破坏DNA分子的立体构型，影响DNA聚合E同DNA结合，从而抑制DNA的复制和转录。如亚德里亚霉素，嵌入相邻的碱基对之间。第63页/共67页化学杀菌剂和抗生素对微生物的影响第64页/共67页 由于化学药物的广泛应用，某些病原M如葡萄球菌，E.coli，痢疾杆菌，结核杆菌等日益严重的表现出抗药性，细菌抗药性表现在如下几个方面：v 菌体内产生了钝化和分解药物的酶:葡萄球菌产生了青霉素E。v 改变细胞膜透性：这类抗性菌株具有阻碍抗微生物剂的进入或排出已进入药物的能力。v 细胞内被药物作用的部位发生了改变，如抗链霉素的E.coli抗性菌株，其核糖体3OS亚基发生改变后，链霉素再不能与之结合。微生物的抗药性第65页/共67页解决耐药性的方法合理使用抗生素，尽量避免使用易于引起细菌耐药突变的抗生素，使用有效的隔离方法，避免耐药基因在不同菌株和菌种的转移注意药物种类、用量及使用时间，能用窄谱的就不要用广谱抗菌药物，能用一种有效的就不必用多种，以避免耐药性和二重感染。努力开发新的抗菌药物，改造化学结构。第66页/共67页谢谢您的观看！第67页/共67页