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1、最新【电子显微镜,分类和电镜样品制备技术】电镜样品制备电子显微镜分类和电镜样品制备技术 电子显微镜技术简称电镜技术，它包括电子显微镜(electronmicroscope)和样品制备技术(techniquesofsamplepreparation)两大方面。电子显微镜的基本原理与光学显微镜相同，但光源和透镜有所不同，电镜利用电子束作光源，电磁场做透镜，因而最佳分辨率可达1-2，放大倍率达150万倍。样品制备技术是制作电镜标本的综合技术，比光学显微镜制片过程更精细和复杂。它包括普通样品制备技术(如超薄切片技术)和特殊样品制备技术(如电镜酶细胞化学技术)。 第一台电镜诞生于1931年，至今已有70
2、余年的历史，经过不断的改进和提高已从最初的一种电镜发展为多种电镜，分辨率可达到1。近年来，随着电镜计算机的一体化，使新型电镜的操作更为简便，图像获取更快捷，而且电镜图像在观察过程中可以得到即时储存和统计分析等，大大提高了电镜的使用效率。 电子显微镜技术是研究细胞超微结构最重要的手段。广泛应用于医学生物学等各个学科，在现代医学科学研究和临床疾病的诊断中发挥着重要的作用。 (一)电子显微镜的种类 电子显微镜是以电子束作光源、电磁场作透镜、具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜通过收集、整理和分析电子与样品相互作用产生的各种信息而获得物体的形貌和结构等。电镜的类型也是利用电子信号的不同和成像的不同而进
3、行分类。主要分为透射电子显微电镜、扫描电子显微电镜、分析电子显微镜和高压电子显微镜。 1、透射电子显微电镜 透射电子显微电镜(transmmisionelectronmicroscope)，是发展最早、应用最广泛的电镜，一般所说的电镜指的便是透射电镜。透射电镜主要用于观察组织细胞的内部结构。 透射电镜由三大系统组成，包括镜体系统、真空系统和电子线路系统。镜体系统是电镜的主体，结构相当复杂，又分为照明系统、成像系统和观察记录系统。 照明系统由电子枪和聚光镜组成，电子枪发射电子作为电镜的照明光源。在电镜中电子射线在几万伏的加速电压作用下产生了短波长高能电子束，加速电压越高，电子束的波长越短，电镜的
4、分辨率就越高。聚光镜则将来自电子枪的电子束会聚在样品上并可调节照明强度等。 成像系统由样品室、物镜、中间镜和投影镜组成，是电镜具有高放大倍率和高分辨率的关键部位，主要是借助改变各个透镜的电流来获得不同的放大倍率。成像系统的总放大倍率是物镜、中间镜和投影镜放大倍数的乘积。 观察记录系统包括观察室和底片室。观察室内有一个荧光屏，电子束穿透样品，带有样品信息的电子经成像系统放大投影到观察室的荧光屏上，激发荧光屏发出可见光，透过的电子多荧光屏亮，反之则暗，荧光屏的亮、暗程度与样品微细结构一一对应，最终产生具有一定反差的影象。图像的保留可通过荧光屏下的底片室内的胶片感光，使图像拍摄下来，也可将图片通过探
5、头输送到计算机中经打印机打出图片。 电镜有复杂的真空系统和电路系统以维持镜筒的高真空状态和稳定的工作条件。 2、扫描电子显微镜 扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope)简称扫描电镜。扫描电镜利用二次电子信号成像，用于观察样品表面形貌，图像具有立体感。 扫描电镜的光源部分与透射电镜相同，是由电子枪产生电子射线经聚光镜聚焦形 成一束极细的光斑称为电子探针(electronprobe)。电子探针受扫描发生器控制，在样品表面进行逐点扫描，把样品表面的原子外层的电子击出，形成二次电子，二次电子被二次电子检测器收集、转换、放大、转换到显象管，由于显象管的荧光屏上的画面与样品被
6、电子束照射面呈严格同步扫描，逐点逐行一一对应，这样就能看出样品表面形貌。 二次电子发射越多的地方，在像上相应的点就越亮，反之则暗。由于二次电子产生的多少与电子束入射角度有关，也就是与样品表面的起伏有关，所以荧光屏上得到的图像反应了样品表面的立体形貌。 3、分析电子显微镜 分析电子显微镜(analyticelectronmicroscope)简称分析电镜，是一种带有特殊附件波谱仪(lengthdisapersivespectroscope)或能谱仪(energydisapersivespectroscope)的电子显微镜。它可以装配在透射电镜上，也可以装配在扫描电镜上。当高速运动的电子会聚成电子
7、束(探针)打到样品上时，所激发出来的X射线波长是和样品内所含元素的原子序数密切相关的。把特征性X射线根据其波长和强度分别加以收集便可推知样品内包含哪些成分及各元素的含量。 利用分析电镜可以在观察样品形貌的同时了解微小区域(如某一细微结构)内所含元素的种类及其含量，在细胞超微结构水平上对其内部的化学元素成分进行定位、定性、定量分析。从而获知结构变化与其组成的元素变化的关系，它的分辨率很高，元素周期表上大部分元素都能分辨出来。 4、高压电子显微镜 高压电子显微镜(highvoltageelectronmicroscope)指加速电压在120KV以上的透射电子显微镜，若加束电压在500KV以上称为超
8、高压电镜。目前世界上超高压电镜最高的加速电压可达3000KV。 高压电子显微镜的主要特点是分辨本领高，对样品的穿透能力强，可用于观察较厚的样品，整体培养的细胞不需超薄切片即可观察内部的三维微细结构，如微丝、微管等，在偏振镜下可呈现三维排列的图象特点。但电镜体积庞大，价格昂贵，难以普及。 (二)电镜样品制备技术 电镜样品制备技术较复杂，种类也较多，分为普通样品制备技术和特殊样品制备技术。这里简单介绍几种常用的样品制备技术。 1、超薄切片技术 超薄切片技术(ultramicrotomy)是透射电镜样品制备方法中最基本的一种。由于电子束穿透能力的限制透射电镜观察的样品必须很薄，普通光镜切片厚度约35
9、m，而透射电镜切片厚度则要求在5080nm左右。这种薄切片称为超薄切片。超薄切片技术样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小。常用的重金属有磷钨酸钠、醋酸铀等。 负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子结构、亚细胞碎片以及分离的细胞器等研究工作。负染色样品不需经过固定、脱水包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。 3、冷冻蚀刻技术 冷冻蚀刻技术(freeze-etchingtechnique)又称冷冻复型，是透射电镜样品制备技术的一种，是将样品经快速冷冻断裂升华喷铂喷碳而最终形成一层印有生物样品断裂面立体结构的复型膜，然后将生物样品腐蚀掉
10、，用铜网将复型膜捞起进行透射电镜观察。 冷冻蚀刻技术能保持细胞原来的结构，立体感鲜明，主要用于生物膜的研究。 4、扫描电镜样品制备技术 扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征，样品制备包括观察面的暴露、固定、脱水、干燥和导电等。 样品制备采用戊二醛和锇酸双重固定;乙醇或丙酮脱水。干燥是扫描电镜样品较 重要的步骤。由于生物样品柔软多水，大多数的组织含水量在80%以上，采用自然干燥，会受表面张力影响使细胞表面收缩，形态改变。所以多采用液体CO2临界点干燥法，在临界状态时表面张力系数为零，也就是分子的内聚力等于零时干燥，细胞不再收缩，保持了原有的形态。由于干燥样品不导电，因而需要在样品表面镀一层薄薄的金属膜使样品导电并增加图像的反差和立体感。 第 6 页 共 6 页