微生物发酵实验指导.docx

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1、微生物发酵实验指导24目 录第一部分 生产菌种的选育及发酵条件优化实验一发酵菌株的初筛实验二发酵菌株的复筛 实验三淀粉酶活力的测定实验四生产菌株发酵条件的优化第二部分 生物反应器的使用实验五发酵罐的构造实验六发酵罐参数的设置及控制实验七发酵罐的操作方法第三部分 补料分批发酵实验八种子的制备 实验九发酵罐培养实验十菌株生长曲线的绘制实验十一发酵过程中还原糖的测定 实验十二发酵过程中乙醇产量的测定第四部分 传统产品的发酵实验十三酸乳的发酵微生物发酵实验本实验内容涉及到分析化学、有机化学、生物化学、微生物学、发酵工艺学及化学过程等学科的基本实验操作，对学生综合实验能力要求较高。学生在上课之前，应对相

2、应内容进行复习。本实验上课期间，希望同学们注意以下几点要求。1. 实验时，每个授课班级学生将分为 3 个大组，每组 7 人左右。各小组设组长一名， 负责协调工作及实验工作分工。在充分征求组员意见的基础上，分工一旦确定，组员必须服从工作安排，自觉、认真完成自己应负责工作。2. 该实验属开放性实验，所有实验内容必须由学生自己完成。在同一时间内，每个大组内将进行不同的实验内容。学生必须对实验内容非常熟悉，思路清晰，才能尽量减少失误。因此学生要对实验内容进行预习。3. 本实验学生分组实验，学生要团结友爱，既要合理分工，也要互相合作，保证实验顺利完成。每个大组实验数据共享，但数据处理过程不共享，否则将影

3、响最后成绩。4. 实验需要使用仪器较多，共用小型仪器放于固定位置，不得随意搬动。5. 实验中要随时保持实验室及实验台面的清洁，以免发酵过程中污染。6. 实验过程中，蒸馏水用量较大，各组要轮流负责打水。7. 使用仪器必须按照教师指导进行，以免发生危险。第一部分 生产菌种的选育及发酵条件优化实验一发酵菌株的初筛一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后， 遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。三

4、、实验用品1. 样品淀粉含量丰富的土样。2. 培养基（1） 肉汤培养基：牛肉膏0.135g，蛋白胨0.45g，NaCl 0.225g，加水至45ml，pH7.0。121灭菌 20min。（2） 初筛平板培养基：牛肉膏0.9g，蛋白胨 3g，NaCl 1.5g，可溶性淀粉 0.6g，琼脂0.54g，加水至 300ml，pH7.4。121灭菌 20min。（3） Lugol 碘液：碘 1g，碘化钾 2g，蒸馏水 300ml。先将碘化钾溶解在少量水中， 再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。3. 器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，玻璃珠，培养皿， 移液管，试

5、管。四、实验方法1. 培养基制备：配制肉汤培养基45ml，装于 250ml 三角瓶中，纱布封口，灭菌。配制初筛平板培养基 300ml，装于 500ml 三角瓶中，封口膜封口，灭菌。2. 倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却至5060，以无菌操作法倒至已灭菌的培 养皿中，每皿约 20ml。冷却凝固待用。3. 样品预处理：取 5g 土样接入 45ml 肉汤培养基中，80水浴 15min。4. 平板涂布分离：以无菌操作法吸取预处理土样悬液适0.1ml，加至制备好的平板上， 以无菌涂布器连续涂布三个平板。将平板倒置，37培养 2448h。5. 保存菌种：将纯化后的菌株转接至斜面培养基上，37培养 487

6、2h，待菌苔长好后，4保存。五、实验结果菌落数量菌落颜色菌落形态平板 118淡黄色，乳白色大小不一，圆形或椭圆形， 周边锯齿形，无规则分布。平板 215淡黄色圆形居多，周边部分光滑部分呈锯齿形，分布不均。平板 319淡黄色菌落分布在中央，个别菌落很大，其余的很小。一、实验目的实验二发酵菌株的复筛1. 学习发酵菌种的复筛方法。2. 从已分离到的微生物中找出具有工业应用前景的菌株。二、实验原理菌种筛选一般分初筛和复筛，前者以量为主，后者以质为主。初筛可在培养皿或摇瓶中进行，优点是快速、直观、简便、工作量小，但测试条件与工业发酵时有很大差别，因此结果不一定可靠；复筛是对生产性能作较精确的定量测定工作

7、，复筛时应尽可能模拟工业生产条件，一般通过摇瓶培养对培养液进行精确的定量分析测定，所得的数据比较有说服力，但工作量较大。为了尽可能使复筛条件与大生产相近，复筛培养基中应加入一些生产性原料。三、实验用品1. 菌株实验一初筛得到的性能优良的淀粉酶生产菌。2. 复筛培养基黄豆粉 1g，玉米粉 1g，Na2HPO4 0.4g， (NH4)2SO4 0.4g ， NH4Cl 0.15g，加自来水至100ml，pH 自然。121灭菌 30min。3. 器材高压灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，移液管。四、实验方法1. 培养基制备：配制复筛培养基 100ml，分装于250ml 三角瓶中，每

8、瓶 30ml，共3 瓶，6 层纱布封口，灭菌。2. 目的菌株的摇瓶培养：挑取 1 环斜面菌苔（或 1 个单菌落），转接于复筛培养基中（每株菌接 3 瓶），37，150r/min 摇床培养 36h。3. 菌株生产性能的测定：取下摇瓶，参照实验三方法对淀粉酶活力进行测定，每瓶测三次。五、思考题菌株的选育为什么要分初筛与复筛？答：初筛，以量为主，可在培养皿或摇瓶中进行，优点是快速、直观、简便、工作量小， 但测试条件与工业发酵时有很大差别，因此结果不一定可靠；复筛，以质为主，是对生产性能作较精确的定量测定工作，复筛模拟工业生产条件， 复筛培养基中应加入一些生产性原料，通过摇瓶培养对培养液进行精确的定量

9、分析测 定，所得的数据比较有说服力，但工作量较大。实验三淀粉酶活力的测定一、实验目的1. 掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法2. 从初筛所获得的菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株二、实验原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括-淀粉酶、淀粉 1，4-麦芽糖苷酶（-淀粉酶）、淀粉 1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的-1，4 糖苷键，形成麦芽糖、含6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在 660nm 处有较大的吸收峰，可以用分光

10、光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定-淀粉酶的活力。三、实验用品1. 粗酶液实验二的摇瓶发酵液离心后可作为粗酶液。2. 试剂（1） 碘原液：称取碘化钾 4.4g，加少量蒸馏水溶解，加入碘 2.2g，溶解后定容至 100ml，贮于棕色瓶中；（2） 比色用稀释碘液：取碘原液 2ml，加碘化钾 20g，用蒸馏水定容至 500ml，贮于棕色瓶中；（3） 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀， 徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min 后冷却，加水定容至 100

11、ml，需当天配制；（4） pH6.0 的磷酸二氢钠柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO 12H O）424.523g，柠檬酸 0.807g，用水溶解并定容至 100ml；（5） 标准糊精溶液：称取纯糊精0.06g，悬浮于少量水中，调匀后倾入90ml 沸水中， 冷却后加水定容至 100ml。滴加几滴甲苯防腐，冰箱保存；（6） 28.75ml 乙酸，加蒸馏水定容至 1L。3器材分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，移液管，烧杯，离心管。四、实验方法1. 标准曲线的绘制：（1） 将可溶性淀粉稀释成 0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；（2） 吸取淀粉稀释液 2.0ml 加至

12、试管中，加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液 1.0ml，40 水浴保温 15min；（3） 加蒸馏水 1ml，40保温 30min 后加入 0.5mol/L 乙酸 10ml；（4） 吸取反应液 1ml，加入稀碘液 10ml，混匀，在 660nm 下测吸光值 A；（5） 以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。表 31 标准曲线的制作1256淀粉稀释液浓度/%00.20.51.01.52.0淀粉稀释液/ml222222缓冲液/ml11111140水浴中保温 5min蒸馏水/ml11111140水浴中保温 30min，加入 0.5mol/L 乙酸 10ml，混匀后吸取反应液 1ml稀碘液/mlA

13、660101010101010试剂管号342. 酶液的制备将实验二所得发酵液离心（4000r/min，30min），取上清液作为粗酶液，以 pH6.0 缓冲液稀释至适当浓度，作为待测酶液。3. 淀粉酶活力测定按下列程序操作：试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）加淀粉稀释液 2.00ml加淀粉稀释液 2.00ml加缓冲液 1.00ml（摇匀）加缓冲液 1.00ml（摇匀）400.2，5min400.2，5min加蒸馏水 1.00ml（摇匀）加粗酶液 1.00ml（摇匀）400.2，30min400.2，30min加乙酸 10.0ml加乙酸 10.0ml混匀混匀取反应液 1.00ml取

14、反应液 1.00ml加稀碘液 10.00ml加稀碘液 10.00ml混匀混匀测定A680测定A680五、注意事项1. 淀粉一定要用少量冷水调匀，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。2. 酶液应该进行适当稀释。六、作业1绘制标准曲线。2A记录各样品的，并计算其酶活力，计算方法参见附录。660七、思考题1. 测定酶活力时，在具体操作上应注意哪些问题？2. 为什么测定酶活力的试剂要在40水浴锅中预热？附：酶活力单位的定义：1ml 酶液在 40、pH 6.0 的条件下，每小时分解的淀粉的毫克数。表示为u/ml。

15、X=AKn式中：X样品的酶活力，u/mlA样品平行试验的平均吸光度K吸光常数n稀释倍数实验四生产菌株发酵条件的优化一、实验目的1. 了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出筛选菌株的最佳发酵条件。2. 掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。二、实验原理发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH 、培养温度和通气状况是三类最主要的发酵条件。培养基 pH 一般指灭菌前的 pH ，可以酸碱溶液调节控制，因发酵过程中pH 会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节；通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，封口纱布的厚度也会影响氧气的传递，一般以68 层为好。发酵培养

16、基是指大生产时所用的培养基，一般碳源含量较高。若产物含氮量高，还应增加培养基中氮源比例。但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压过高，会反过来抑制微生物的生长，可考虑以流加的方法逐步加入碳氮源。工业发酵培养基与菌种筛选时所用培养基不同，以经济节约为主，一般选用廉价的农副产品为原料。由于天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，因此发酵前必须进行培养基的优化试验。本实验将对菌株的培养基配方进行优化。三、实验用品1菌种实验二或实验四筛选得到的淀粉酶生产菌。2器材摇床，高压灭菌锅；三角瓶，烧杯，移液管，试管。四、实验方法1. 培养基制备：以黄豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作为培养基的主要影响因素

17、， 每一因素设定3 个水平，按表4-1配制培养基（W/V ），另加入Na 2HPO 4 0.8%，(NH 4)2SO 4 0.4%， NH 4Cl 0.15%，分装于 250ml 三角瓶，每瓶 30ml，6 层纱布封口，灭菌。取5ml 蒸馏水加入试管中，灭菌。2. 接种：挑取斜面菌苔 5 环接入 5ml 无菌水中，摇匀后用无菌移液管吸取 0.5ml菌悬液，接到每一组培养基中。37，150r/min摇床培养 36h 左右。3. 结果测定：参照实验三方法测定菌株在各培养基中培养的淀粉酶活力。表 4-1 发酵培养基优化正交试验表组因素A因素B因素C因素D酶活力别黄豆粉玉米粉淀粉酵母膏/(U/ml)1

18、13%11%13%10.4%213%22%25%20.6%313%33%37%30.8%425%11%25%30.8%525%22%37%10.4%625%33%13%20.6%737%11%37%20.6%837%22%13%30.8%937%33%25%10.4%五、作业将酶活力测定结果填入表 4-1，通过正交分析，确定三个因素对酶活力影响的主次顺序， 并确定最适培养基配方。六、思考题如果不用正交实验，四因素三水平的实验共需做几组？搅拌电机进气进蒸气进水排水排汽2第二部分 生物反应器的使用实验五 发酵罐的构造一、实验目的了解机械搅拌发酵罐的一般构造。二、实验用品上海高机微生物发酵罐BIOF

19、-2007。三、实验方法1. 罐体系统组成本实验所使用发酵罐罐体结构图见图5-1，罐体见图 5-2、5-3，各部件名称见表 5-1。图 5-1 7L 发酵罐罐体结构表 5-1发酵罐各部件名称一览表1电加热器12测温电极（2）23恒温水槽2测温电极（1）13泡沫电极24液位电极3水位电极14pH 电极4补料瓶15快速接头AQ安全阀5呼吸过滤器16排气冷凝器W1溢水阀6补料蠕动泵17测温电极（3）W2排水排汽阀7冷凝器进水阀18尾气过滤器S进蒸汽阀8进气流量计19尾气滤水器EW冷却水电磁阀9灭菌罩20取样放料装置G气路调节阀10进气过滤器21罐盖P1P2压力表11DO 电极22回水管控制面板LCD

20、显示器电脑控制系统电源开关执行器动作指示灯酸泵自动方式指示灯碱泵消泡泵无纸记录仪(选配件)，你可能没选，或者使用了上位机补液泵电源总开关蠕动泵手动开关图 5-2 发酵罐罐体图 5-3 加灭菌罩的发酵罐罐体2. 控制机箱和控制面板本实验所使用发酵罐控制机箱及控制面板如图54 所示。图 5-4 发酵罐控制机箱实验六 发酵罐参数的设置及控制一、实验目的1. 了解常用发酵参数的检测方法。2. 学会常用发酵参数的设置及控制。二、实验用品上海高机微生物发酵罐BIOF-2007。三、实验方法1主菜单BIOF-2000 RUN/EDIT/CALIB/STERIL打开电脑控制系统电源开关，LCD 显示器显示出主

21、菜单。用左右箭头键移动光标选择命令。按ENTER 键确定命令并立即执行。RUN(运行)命令：根据所设置的参数进行控制运行，如果要求控制系统真正完成控制作用，必须于此前将电源总开关打开。EDIT(设置)命令：用于设置各控制对象参数，设置完毕用ESC 键退出。CALIB(CALIBRATION 校正)命令：用于校正电极及蠕动泵。STERIL(STERILIZATION灭菌)命令：是为灭菌过程而设置的辅助程序。2RUN 命令选择 RUN 命令将进行发酵运行控制，控制的参数可以在EDIT 中设置，运行时有二种显示界面。第一种界面:RUN STIRR: TEMP: PH:*rpm*AUTO+/-+/-R

22、UNCO2:* DO2:*rpmAT FOAMPUMP SUB/HARVPUMPAUTO+/-+/-根据EDIT 中的设定显示第二种界面:根据EDIT 中设定显示（图中“*”部分为实时参数。当实时参数闪动时，表明该参数超越了限定范围。）用 ALTER 键可以实现两种界面的切换。每一个控制参数有AUTO、HAND、OFF 状态可选。运行状态时可以由HALT 键进入命令选择菜单，由此可以直接进入EDIT 或 CALIB。3. EDIT 命令EDIT PH/DO/TEMP/STIRR/PUMPS/ ST-DO SET / MODE编辑各参数时用箭头键+数字键实现数字部分的设定。当光标移到方式设置位置

23、时（如EDITPH: *PH UPLIMIT: * PH DWLIMIT: *方式位置AUTO+/-+/-图中箭头所指部分），按ENTER 键可选择控制方式：AUTO（自动，即按照用户设置参数进行控制）、HAND（手动，运行时可以用 ENTER 键实现手控，例如，将光标移到 TEMP 行“+”号上，再按 ENTER 就可以启动加热器进行加热。）、OFF（关闭，只显示各参数运行值，但不能对其进行控制）。各参数可设置相应上下限值，UPLIMIT 表示上限，DWLIMIT 表示下限，设置完毕用ESC 键退出。在 EDIT 界面中，选择 MODE 便进入补料方式设置，根据情况有六种补料方式可以选择：方

24、式 1PHXX.X+SUBSTRATE，即：酸碱度大于某 pH 值时进行补料； 方式 3DOXX+SUBSTRATE，即：溶解氧大于某 DO 值时进行补料； 方式 4DOXX.X+DOXX+SUB，即：酸碱度或溶解氧大于某数值时补料； 方式 6LEVEL LOWER+SUB，即：发酵液液位低时补料。注意，补料速率可以通过设置补料泵的占空百分比（可在CALIB/PUMP4 中选择 20， 40，60，80，100%，）来确定。在确定了补料方式后，只需用ESC 键退出即可。设置时系统会自动储存设定参数，即便掉电也不会丢失数据。设置完毕后，用ESC 键退出。如果从 RUN 状态直接进入EDIT，退出

25、时回到RUN 状态；如果从 MAIN 状态直接进入 EDIT，退出时回到MAIN 状态。4. CALIB 命令（1） pH 电极的校正PH: *.* TEMP: * *SLOPE: *.* ZERO:*CALIB AUTO+/-+/-进入 pH 校正后，显示界面如下图所示。校正时，温度补偿是自动的，校正温度应选择于发酵液工作温度附近。操作人员须将随机提供的温度电极和 pH 电极一同插入中性标准溶液，如pH=6.86，通过面板调整零位ZERO(用箭头键移动光标到 ZERO 行的+/-上,按 ENTER 键即可)，使屏幕上 pH 指示值接近6.86；再将pH 计和温度电极一起插入标准的酸性或碱性溶

26、液（根据发酵液pH 范围选择），如 pH=4.0，调整斜率 SLOPE (用箭头键移动光标到SLOPE 行的+/-上，按 ENTER 键即可) ， 使 pH 指示接近 4.0，再重复上述过程 12 次，使 pH 指示达到标准溶液的pH 值即可。校正完毕用ESC 键退出。注：斜率SLOPE 的变化范围：0.391.89，零位ZERO 的变化范围 122143。实罐灭菌后及发酵过程中应对pH 电极进行在线校正。从罐内取出样品后，即用标准 pH 计检测样品的pH 值，再进入CALIB 程序，调整零位ZERO，使液晶显示器显示的pH 值与标准 pH 计显示值相同。（2） DO 电极的校正进入DO 电极

27、校正后，显示界面如下图所示。DO2:*% TEMP:*SLOPE: *.* ZERO: *CALIB AUTO+/-+/-校正时，温度补偿是自动的，校正温度应选择在发酵工作温度附近。操作员将溶氧电极放入亚硫酸钠饱和溶液，调整零位ZERO，使 DO 指示接近于 0%，最好为 1%2%；然后将溶氧电极取出，以湿度饱和的空气作为100% 溶氧量来标定，调整斜率SLOPE 使DO 达到 100%；重复上述过程 12 次即可。校正完毕用ESC 键退出。注：SLOPE 的调整范围：0.52.0，ZERO 的调整范围：125。实罐灭菌后，当发酵罐的温度、通气量、罐压都已达到所需值并已稳定时，应对DO 电极进

28、行在线校正。进入 CALIB 程序，调整斜率 SLOPE，使液晶显示器显示的 DO 值达到 90 100% 。5. STERIL 命令STERILIZATIONSTIRR：* RPMSETMTEMP：*STEMP：*STERIL TIME：*MINOK在主菜单中选择STERIL 命令后，LCD 显示灭菌设置界面：各参数设置完毕后，移动光标至OK 上，按ENTER 键即进入灭菌状态。显示界面：STERILSTIRR：* RPMTEMP：*STOP*REMAINTIME：* MIN灭菌时，当罐内温度达到所设置的灭菌温度STEMP 时，灭菌计时开始，同时鸣叫提醒操作人员注意（按*键可消除鸣叫）。灭菌

29、计时到，蜂鸣器鸣叫提示灭菌结束。对于 510L 的在位灭菌玻璃罐，灭菌设置时应将中间温度MTEMP 和搅拌速度STIRR 设置为零。一、实验目的实验七 发酵罐的操作方法学会发酵罐的使用方法。二、实验用品7L 机械搅拌式发酵罐，蒸汽发生器，空气压缩机。三、实验方法1. 开机：先开电源总开关，再打开电脑控制系统电源开关。2. 灭菌准备工作（1） 关闭溢水阀和罐体上其它阀门；取下挡水螺栓；拔下pH、DO、泡沫、液位电极及搅拌电机、顶盖接地线的连接插头；取出测温电极，放置在干燥的机箱上。注：拔下的连接插头不可互相缠绕接触，不可与罐体接触，不可受潮，应放在干燥的机箱上。（2） 拧下冷凝器进、出水接头；用

30、专用内六角扳手旋松搅拌电机固定螺栓，取下电机，横放在柔软、干燥桌面上。（3） 将密封固定架安装于轴套上，将瓶架安装于密封固定架上。（4） 将进气过滤器、尾气过滤器、尾气滤水瓶、取样放料装置、呼吸过滤器安装到位。（5） 打开蒸汽发生器准备提供蒸汽。3. 空消（1） 装上 pH 电极孔、DO 电极孔、三针补料口的堵头。（2） 将密封固定架安装于轴套上，将瓶架安装于密封固定架上，将进气口、取样口、补料口各胶管弯曲并用专用夹夹紧，将尾气过滤瓶安装于瓶架上。注：尾气口必须敞开。（3） 盖上灭菌罩，拧紧固定螺丝，插上测温电极的插头。（4） 打开面板控制开关，选择灭菌辅助程序，设置灭菌温度STEMP(105

31、130)与灭菌时间STIMER，将搅拌转速设置为0rpm，将中间温度MTIME 设置为 0，并进入程序运行（见实验七，步骤 5）。注：此时仪器的电源总开关应为关闭状态。（5） 提供蒸汽源，打开S进蒸汽阀、W2-排水排气阀，让蒸汽不断进入罐内，使罐体温度不断升高。当灭菌罩温度和恒温槽温度升至100左右后，逐渐关小W2，使温度继续上升，直到升到所需温度（注意对应压力）。当温度达到设定的灭菌温度时，计时开始。这时应不断调节S 和 W2 使得温度稳定在设置温度上。操作时应密切注意灭菌罩上的压力表指示和控制箱上的温度指示，保证压力不超过0.2Mpa，温度不超过 130。（6） 当设定的灭菌时间到时，仪器

32、发出鸣叫报警，此时将 S进蒸汽阀和蒸汽源关闭。此时W2 可略开大一些，使罐压逐渐释放。（7） 当罐压到常压状态时，将W2-排水排汽阀全打开，放尽冷凝水。（8） 小心取下灭菌罩，空消完成。注意防止内部的瓶子掉下。4. 实消（1） 按步骤 2 做好准备工作。（2） 装上已校正好的pH、DO 电极并旋上保护盖（或者用牛皮纸包扎也可以），以防止灭菌时电极被蒸汽弄潮而损坏。（3） 放入发酵培养液。（4） 同步骤 3 中(2)(5)。（5） 当设定的灭菌时间到时，仪器发出鸣叫报警，此时将蒸汽源关闭，将S 阀关闭，W2 微开，让罐体自然冷却。（6） 当罐内温度降到 50以下，罐内压力达到常压状态时，小心取下

33、灭菌罩，将W2-排水排汽阀关闭，实消完成。实消完成后，应尽快通入空气，保证罐内不处于负压状态。5. 发酵准备（1） 安装 22回水管堵头，关闭W2排水排汽阀，打开W1溢流水阀，打开冷却水源。（2） 关闭G气路调节阀，连接空气压缩机与发酵罐的进气端。打开空压机，检查空压机出口端、7减压除水过滤器的压力，将压力调整至0.10.15MPa。注：发酵罐内空气压力必须小于 0.1MPa。当发现压力难以调整时，应关闭7减压除水过滤器，将G气路调节阀打开，然后重新进行调整。（3） 将 10进气过滤器与P1压力表用硅胶管连接。先打开G气路调节阀，然后松开进气、尾气口胶管夹头，将气量调节至工艺所需的流量。注：必

34、须检查 10进气过滤器、18尾气过滤器、19尾气过滤瓶及气路是否堵塞。玻璃罐内压力必须小于 0.1Mpa。（4） 安装好搅拌电机和顶盖接地线。（5） 插入 12测温电极(2)。取下DO、pH 电极上的保护盖或防护牛皮纸，连接DO电极、测温电极、泡沫电极、pH 电极和电机的插头。（6） 将补料瓶的输液胶管安装在对应蠕动泵上，然后松开补料口胶管夹头。注：蠕动泵运转方向与胶管安装方向。（7） 在非运行（即非RUN）状态下，打开总电源开关。设置较低的罐体温度，进入RUN，使罐体温度较快下降。6. 接种（1） 酒精盘内放入无水酒精或酒精棉，点燃后安放于接种口，适当加大通气量或减小尾气流量。（2） 打开接

35、种盖，将其放入干净灭菌纱布中。（3） 将菌种瓶口放在火焰上烧一下，并在火焰上拔下瓶塞将菌种倒入发酵罐。（4） 将接种盖放在火焰上烧一下，盖上接种盖。（5） 按工艺要求恢复罐压和通气量。d软管夹取样三通e取样回气口取样瓶罐盖放料取样管（6） 对 pH 电极进行在线校正，将DO 电极校正至 100%。7取样（见图 7-1）图 7-1 取样示意图（1） 夹紧尾气胶管（使罐内适当增压，但罐压不得大于0.10Mpa）。（2） 弯曲夹紧胶管的“ d ”部位；调节“e”部位胶管压板, 放去少量培养液后夹紧胶管。（3） 把无菌取样瓶置于酒精焰上，拔去瓶塞对准取料口，调节“e”点压板，从取料胶管取出所需样品后再

36、夹紧“e”点夹子，盖上取样瓶盖, 夹紧取样管口的胶管。（4） 松开 d 部位和“e”部位的夹子，放去胶管内的残料。（5） 取样前后应用 75% 酒精对取料口消毒。8. 关机顺序：先关电脑控制系统电源开关，再关总电源开关。9. 发酵罐的清洗（1） 取出 pH、DO 电极按其要求保养。（2） 取下顶盖其它电极、电机及其连线插头，拧下进气胶管、冷凝器接头。（3） 拧松罐盖紧固螺丝，小心垂直向上取出罐盖横置于平整桌面，垫好、不要碰撞， 刷洗干净罐内部件。注：罐盖搬动清洗时只能抓住轴套或顶盖，不能抓搅拌轴、叶轮和其它易变形部件。（4） 清洗后安装要注意罐内密封圈、硅胶垫就位情况。拧紧罐盖四个紧固螺丝，用

37、力要平衡并注意罐与罐座间隙均衡，螺丝不要拧得过紧以免损坏玻璃罐。注：培养结束和再次使用前都必须清洗罐体及相关部件，清洗时应注意电器元件、电极接口不能进水、受潮。第三部分补料分批培养实验八 种子的制备一、实验目的了解发酵工业种子的制备工艺及质量控制。二、实验原理种子的制备主要是菌种的扩培，即将保存菌种活化后，再经过摇瓶、茄子瓶或种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件获得代谢旺盛、数量足够的种子。这样的种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。通常，种龄以生命力处于旺盛的对数生长期，且菌体量未达到最高峰时较为合适。三、

38、实验用品1. 菌种：大肠杆菌。2. 种子培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏 0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。121灭菌 20min。3. 器材摇床，电炉，pH 计，天平，糖度计，高压灭菌锅；烧杯，移液管，试管，三角瓶。四、实验方法（1） 培养基制备：配制种子培养基 500ml，分装于 500ml 三角瓶，每瓶 100ml，共 5瓶，灭菌。（2） 接种：从斜面上挑取两环菌体，接入 100ml 豆芽汁培养基中，30，150rpm 培养 1520 h。实验九发酵罐培养一、实验目的了解发酵罐的操作。二、实验原理微生物的发酵培养方法有静置培养法、振荡培养法、通气搅拌培养法等。本实验以 7L发酵罐培

39、养酵母菌，从而说明机械搅拌发酵罐的使用方法。三、实验用品1. 菌种采用实验八制备的种子液。2. 发酵培养基蛋白胨 1%，牛肉膏 0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。121灭菌 30min。3器材7L 发酵罐，蒸汽发生器，空气压缩机，pH 计，天平；烧杯，移液管，试管。四、实验方法1. 发酵罐的空消：发酵罐中加约 70%（4.9L）的蒸馏水，参照实验七步骤 3 的方法灭菌，121灭菌 30min。灭菌结束后，冷却至室温，倒掉罐中水，准备实消。2. 发酵罐的实消：在发酵罐中加入 4.5L 发酵培养基。参照实验六步骤 4 的方法校正pH 电极、DO 电极。参照实验七步骤 4 的方法灭菌，12

40、1灭菌 30min。3接种前准备：灭菌结束后，连接进气管路，通入空气。接通冷却水管路，打开冷却水，打开搅拌在低速 100r/min 下进行培养基冷却。使用温度调节装置，接上有关传感器与检测装置，以及流加消泡剂管线。当发酵罐内温度维持在37后，准备接种。4. 接种：提高罐压至0.05MPa，参照实验七步骤7 取样，用于接种前培养基成分分析。参照实验七步骤6，将 500ml 种子液加入发酵罐中。调节搅拌转速至200r/min，通风量 100L/h，罐压 0.04MPa，开始培养。校正 pH 电极，使之与测定值相吻合。在通风与搅拌的作用下， 使培养液中 DO 与空气中的氧气达成平衡状态。当发酵罐中温

41、度稳定后，校正 DO 电极至100%。5. 流加发酵：流加葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度维持在2030g/L；流加 0.1mol/L 氨水， 维持 pH 5.0；通过调节风量和搅拌转速维持溶氧浓度在30%左右。6. 取样：参照实验七步骤7 取样，自培养操作开始起，每2h 取一次样。菌种进入对数生长期后，每隔 1h 取一次样。参照实验十、十一、十二方法分析样品。7. 放罐：当乙醇浓度不再明显增加，即达到放罐标准，及时放罐。除取出足够量培养液作为分析样品外，剩余培养液要进行杀菌处理。8. 清洗：参照实验七步骤 9 方法对发酵罐进行清洗。五、作业在培养过程中，每隔 1h 记录如下参数：pH 值、温度、转速

42、、通风量、DO 值、罐压， 结果填入表 9-1。表 9-1 培养过程中各发酵参数时间/hpH 值DO 值/%温度/转速/(r/min)通风量/(L/h)罐压/Mpa 012345678一、实验目的实验十菌株生长曲线的绘制1. 了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。2. 学习微生物生长曲线的测定方法。二、实验原理将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中，在适宜条件下培养，定时测定培养液中微生物的生长量，以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的曲线即为生长曲线。它反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律，可分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。测定微生物生长量的方法很多，如血球

43、板计数法、平板活菌计数法、比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于菌悬液浓度与吸光度成正比，可以吸光度与时间作图，即可绘制生长曲线。三、实验用品1. 试样实验九不同时间所取发酵液。2. 器材分光光度计；烧杯，试管，滤纸，擦镜纸。四、实验方法1取约 5ml 样品，以未接种的培养基为空白对照，测定各样品在 550nm 处的吸光度OD，每个样品平行测定 2 次，取平均值。5502以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。五、作业将OD550测定结果填入表 10-1，并绘制生长曲线。表 10-1 不同培养时间的菌体生长量培养时间/h0234OD550六、思考题5671. 每次从发酵罐中取出一定体积的样品进行测定，会对结果产生怎样的影响？2. 测定生长曲线时，除比浊法，还有哪些方法？它们各有哪些优缺点？实验十一发酵过程中还原糖的测定一、实验目的1. 了解还原糖在发酵过程中的意义。2. 学习还原糖的测定方法。二、实验原理还原糖是发酵过程