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1、微生物发酵工程实验微生物发酵工程实验第1页，本讲稿共11页实验内容实验内容v实验一实验一 机械搅拌发酵系统结构与控制系统机械搅拌发酵系统结构与控制系统v实验二实验二 中试搅拌发酵罐的使用与维护中试搅拌发酵罐的使用与维护v实验三实验三 培养基的分批灭菌培养基的分批灭菌v实验四实验四 磷细菌高密度发酵磷细菌高密度发酵v实验五实验五 喷雾干燥喷雾干燥第2页，本讲稿共11页时间安排时间安排v11月月8、9、12日下午，熟悉发酵罐系统。日下午，熟悉发酵罐系统。v11月月15日周一，单因子实验，优化磷细菌发日周一，单因子实验，优化磷细菌发酵培养基的碳源。酵培养基的碳源。v11月月16日周二下午，日周二下午
2、，单因子实验，优化磷细菌发酵培养基的碳源。单因子实验，优化磷细菌发酵培养基的碳源。（完成系列稀释、涂布，发酵液还原糖测定）（完成系列稀释、涂布，发酵液还原糖测定）发酵罐开盖，清洗。发酵罐开盖，清洗。磷细菌种子制备磷细菌种子制备第3页，本讲稿共11页v11月月17日周三上午，发酵系统启动，日周三上午，发酵系统启动，pH电极电极标定，溶氧电极标定，发酵培养基配制、装罐。标定，溶氧电极标定，发酵培养基配制、装罐。v周三下午，培养基分批灭菌。灭菌培养基取样、周三下午，培养基分批灭菌。灭菌培养基取样、无菌检查。无菌检查。v周三晚上，种子无杂菌检查。接种，上罐，发周三晚上，种子无杂菌检查。接种，上罐，发酵
3、控制，接种后取样测定（细菌数量、酵控制，接种后取样测定（细菌数量、pH、还原糖等）。还原糖等）。v周三晚上，夜班，关注发酵控制参数，周三晚上，夜班，关注发酵控制参数，第4页，本讲稿共11页v周四上午，取样测定（细菌数量、周四上午，取样测定（细菌数量、pH、还原、还原糖、杂菌率等）糖、杂菌率等）v周四下午，取样测定（细菌数量、周四下午，取样测定（细菌数量、pH、还原、还原糖、杂菌率等）糖、杂菌率等）v周五上午，放罐，清洗发酵罐；计数摇瓶实验周五上午，放罐，清洗发酵罐；计数摇瓶实验结果结果v周五下午，喷雾干燥。周五下午，喷雾干燥。第5页，本讲稿共11页优化磷细菌发酵培养基的碳源（单因子实验）优化磷
4、细菌发酵培养基的碳源（单因子实验）v菌种：无机磷细菌菌种：无机磷细菌v培养基培养基发酵培养基发酵培养基A：可溶性淀粉：可溶性淀粉0.6%，硫酸铵，硫酸铵0.5%，硫酸镁，硫酸镁0.06%，磷酸，磷酸氢二钾氢二钾0.1%，酵母粉，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5发酵培养基发酵培养基B：葡萄糖：葡萄糖0.2%，可溶性淀粉，可溶性淀粉0.4%，硫酸铵，硫酸铵0.5%，硫酸，硫酸镁镁0.06%，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾0.1%，酵母粉，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5发酵培养基发酵培养基C：葡萄糖：葡萄糖1%，硫酸铵，硫酸铵0.5%，硫酸镁，硫酸镁0.06%，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾0.1%，
5、酵母粉，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5发酵培养基发酵培养基D：葡萄糖：葡萄糖1%，玉米粉，玉米粉0.6%，硫酸镁，硫酸镁0.06%，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾0.1%，酵母粉，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5无机磷培养基：葡萄糖无机磷培养基：葡萄糖1%，(NH4)2 SO4 0.5%，NaCl 0.03%，KCl 0.03%，FeSO47H2O 0.003%，MnSO44H2O 0.003%，Ca3(PO4)2 1%，琼脂，琼脂2%，pH 7.0-7.5第6页，本讲稿共11页v实验步骤实验步骤配制培养基，分装于配制培养基，分装于150或或250 mL三角瓶，包扎三角瓶，包扎后，后，1
6、15 灭菌灭菌20 min。发酵培养基。发酵培养基A/B/C/D各各3瓶。瓶。接种，接种量接种，接种量1%。培养，培养，28、150 rpm培养培养18-24 h.测定细胞数量，取发酵液测定细胞数量，取发酵液1 mL系列稀释，取系列稀释，取0.1 mL菌液涂布无机磷培养基，菌液涂布无机磷培养基，28 恒温培养恒温培养3 d后后计数。计数。第7页，本讲稿共11页灭菌培养基无菌度测定灭菌培养基无菌度测定v（1）显微镜观察法）显微镜观察法利用刚果红染色法可以在显微镜下快速区别死活菌。利用刚果红染色法可以在显微镜下快速区别死活菌。原理：活菌具有排斥染液的能力，而死菌失去了排斥染液的能力，因此，原理：活
7、菌具有排斥染液的能力，而死菌失去了排斥染液的能力，因此，无色透明的是活菌，死菌为蓝色或浅蓝色。无色透明的是活菌，死菌为蓝色或浅蓝色。方法：将待测稀释液与一滴刚果红染色液很薄的均匀涂在载玻片上，风干后方法：将待测稀释液与一滴刚果红染色液很薄的均匀涂在载玻片上，风干后滴盐酸滴盐酸1-2滴，涂片变蓝，风干后在高倍镜或油镜下观察。滴，涂片变蓝，风干后在高倍镜或油镜下观察。刚果红溶液：称取刚果红刚果红溶液：称取刚果红0.1-0.2 g，溶于，溶于10 mL水中。水中。盐酸酒精溶液：盐酸酒精溶液：95%酒精酒精1-2 mL，蒸馏水，蒸馏水10 mL，再加入浓盐酸，再加入浓盐酸0.25-0.3 mL混合即成
8、。混合即成。v（2）平板培养法）平板培养法可取出少量灭过菌的培养基置于可取出少量灭过菌的培养基置于37 恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养24 h，若无菌，若无菌生长，即视为灭菌彻底。生长，即视为灭菌彻底。第8页，本讲稿共11页磷细菌高密度发酵磷细菌高密度发酵v菌种：无机磷细菌菌种：无机磷细菌v培养基培养基种子培养基见讲义第种子培养基见讲义第7页页发酵培养基发酵培养基A无机磷培养基见讲义第无机磷培养基见讲义第7页页LB培养基见讲义第培养基见讲义第7页页v种子制备种子制备配制种子培养基，分装配制种子培养基，分装100mL/500mL三角瓶，包三角瓶，包扎，扎，115灭菌灭菌20min，接种，接种，
9、28、150rpm培养培养18-24h问题：用于接种发酵罐，接种量问题：用于接种发酵罐，接种量5%，请问，请问7L培养培养基需要多少菌种用量？基需要多少菌种用量？第9页，本讲稿共11页v种子接入发酵罐种子接入发酵罐种子质量检查种子质量检查（包括哪些项目？分别用什么方法（包括哪些项目？分别用什么方法？）？）接种前还需要做什么？接种前还需要做什么？火圈接种法火圈接种法接种后需要做什么？接种后需要做什么？发酵参数调试稳定，如温度控制发酵参数调试稳定，如温度控制系统，空气流速，罐压，系统，空气流速，罐压，pH等。等。培养基灭菌质量检查培养基灭菌质量检查第10页，本讲稿共11页v发酵控制发酵控制pH泡沫泡沫菌体浓度和形态菌体浓度和形态还原糖还原糖发酵终点发酵终点第11页，本讲稿共11页