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1、四、高等植物基因工程四、高等植物基因工程高等植物的遗传学特征高等植物的遗传学特征高等植物基因工程的基本概念高等植物基因工程的基本概念高等植物的基因转移系统高等植物的基因转移系统高等植物的基因表达系统高等植物的基因表达系统（一）高等植物的遗传学特征（一）高等植物的遗传学特征（一）高等植物的遗传学特征（一）高等植物的遗传学特征植物的基本特征植物的基本特征遗传操作的简易性遗传操作的简易性整株植物的再生性整株植物的再生性染色体的多倍体性染色体的多倍体性1、植物的基本特征、植物的基本特征植植 物物低等植物低等植物高等植物高等植物含根、茎、叶、花、果分化器官含根、茎、叶、花、果分化器官合子经胚再发育为个体
2、合子经胚再发育为个体苔藓门、蕨类门、裸子门、被子门苔藓门、蕨类门、裸子门、被子门无根、茎、叶等分化器无根、茎、叶等分化器官官合子不经胚直接发育为个体合子不经胚直接发育为个体藻类、地衣藻类、地衣2、遗传操作的简易性、遗传操作的简易性 多多数数高高等等植植物物有有自自我我授授精精的的遗遗传传特特征征，能能产产生生大大量量的的后后代代；借借助助于于如如风风、重重力力、昆昆虫虫传传播播等等自自然然条条件件，授授精精范范围围广广、速速度度快快、效效率率高高，即即便便是是频频率率极极低低的的基基因因突突变变和和重重组组事件，其遗传后果也易被观察。事件，其遗传后果也易被观察。3、整株植物的再生性、整株植物的
3、再生性 将将一一小小片片鲜鲜嫩嫩的的愈愈伤伤组组织织置置于于含含合合适适营营养养和和植植物物生生长长激激素素的的组组织织培培养养基基中中，细细胞胞会会持持续续生生长长并并分分裂裂。将将这这些些细细胞胞涂涂在在特特定定固固体体培培养养基基上上，会会长长出出新新的的幼幼芽芽，并并重重新新分分化化成成叶叶、根根、茎茎，最最终终成为整株开花植物。成为整株开花植物。愈伤组织：愈伤组织：植物损伤后，在伤口长出的软组织。植物损伤后，在伤口长出的软组织。生生长长素素/分分裂裂素素的的比比例例高高，则则根根部部发发育育；比例低，则茎部发育。比例低，则茎部发育。愈愈伤伤组组织织的的细细胞胞分分化化取取决决于于植植
4、物物生生长长素素(auxins)和和分裂素分裂素(cytokinins)的相对浓度的相对浓度。大大多多数数单单子子叶叶农农作作物物（如如谷谷类类作作物物）很很难难从原生质再生出完整细胞。从原生质再生出完整细胞。植植物物细细胞胞具具有有纤纤维维素素构构成成的的细细胞胞壁壁，通通常常不能有效吸收外源不能有效吸收外源DNA。用用纤纤维维素素酶酶处处理理植植物物细细胞胞壁壁，形形成成原原生生质质体体，吸吸收收DNA分分子子后后，经经过过再再生生、愈愈伤伤组组织织形形成成，培育出整株植物。培育出整株植物。4、染色体的多倍体性、染色体的多倍体性 多多倍倍体体植植物物在在组组织织培培养养过过程程中中呈呈现现
5、较较高高的的遗传不稳定性遗传不稳定性，导致体细胞变异。，导致体细胞变异。大大约约2/3的的禾禾本本科科植植物物呈呈多多倍倍体体型型，染染色色体体数目数目24-144。很很多多高高等等植植物物拥拥有有比比人人类类更更大大的的基基因因组组，并以多倍体形式存在。并以多倍体形式存在。（二）高等植物基因工程的基本概念（二）高等植物基因工程的基本概念（二）高等植物基因工程的基本概念（二）高等植物基因工程的基本概念高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物细胞基因表达技术高等植物细胞基因表达技术高等植物转基因技术高等植物转基因技术转基因植株转基因植株改良农作物遗传性状改良农作物遗传性状植物工程细胞植物工程细胞
6、大规模生产蛋白多肽药物大规模生产蛋白多肽药物高等植物基因工程的发展历程高等植物基因工程的发展历程1983：美国和比利时科学家首次将外源基因导入美国和比利时科学家首次将外源基因导入 烟草和胡萝卜；烟草和胡萝卜；1994：世界上第一种耐储藏番茄在美国批准上市；世界上第一种耐储藏番茄在美国批准上市；1995：转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国 投入生产；投入生产；2000：美国转基因大豆的种植面积首次超过普通美国转基因大豆的种植面积首次超过普通 大豆。大豆。转转基基因因技技术术虽虽然然只只有有27年年的的历历史史，但但所所涉涉及及的作物种类甚多。的作物种类甚多。
7、包包括括：水水稻稻、玉玉米米、马马铃铃薯薯、小小麦麦、黑黑麦麦、红红薯薯、大大豆豆、豌豌豆豆、棉棉花花、向向日日葵葵、油油菜菜、亚亚麻麻、甜甜菜菜、甘甘草草、卷卷心心菜菜、番番茄茄、生生菜菜、胡胡萝萝卜卜、黄黄瓜瓜、芦芦笋笋、苜苜蓿蓿、草草莓莓、木木瓜瓜、猕猕猴猴桃桃、越越橘橘、茄茄子子、梨、苹果、葡萄。梨、苹果、葡萄。至至2009年年底底，全全球球已已有有25个个国国家家批批准准了了24种种转转基基因因作作物物的的商商业业化化种种植植，种种植植面面积积由由1996年年的的170万公顷发展至万公顷发展至1.34亿公顷，亿公顷，14年间增长年间增长79倍倍。最最常常见见的的转转基基因因作作物物是
8、是转转基基因因大大豆豆、棉棉花花、玉玉米米、油油菜菜，其其中中转转基基因因大大豆豆占占全全球球大大豆豆种种植植总总面面积积的的72%，转转基基因因棉棉花花占占全全球球棉棉花花种种植植总总面面积积的的47%。（三）高等植物的基因转移系统（三）高等植物的基因转移系统（三）高等植物的基因转移系统（三）高等植物的基因转移系统根癌农杆菌介导的根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法质粒转化法植物病毒介导的转染植物病毒介导的转染植物细胞的直接转化植物细胞的直接转化植物原生质体的再生植物原生质体的再生植物基因工程中的选择标记和报告基因植物基因工程中的选择标记和报告基因 根根癌癌农农杆杆菌菌(A.tumefaciens
9、)是是普普遍遍存存在在于于土土壤壤中中的的一一种种革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌，能能在在自自然然条条件件下下特特异异性性感感染染几几乎乎所所有有双双子子叶叶植植物物（尤尤其其豆豆科科类类植植物物）的根部和的根部和受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。1、根癌农杆菌介导的、根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法质粒转化法 根根癌癌农农杆杆菌菌的的这这种种致致瘤瘤特特性性是是由由其其内内的的野野生生型型Ti(Tumor-inducing)质粒介导的。质粒介导的。根根癌癌农农杆杆菌菌通通过过侵侵染染植植物物伤伤口口进进入入细细胞胞后后，将将T-DNA插入植物基因组中，随其复制而复制。插入植
10、物基因组中，随其复制而复制。编编码码合合成成冠冠瘿瘿碱碱(opine)的酶系。的酶系。Ti质粒的结构：质粒的结构：tmstmr tmt opine代谢区代谢区Vir区区Ti plasmidoriT-DNAleft borderright border 编编码码合合成成植植物物生生长长素素(auxin)的酶系；的酶系；编编码码合合成成细细胞胞分分裂裂素素(cytokinin)的酶系；的酶系；T-DNA：12-24 kbtms：tmr：tmt：160-240 kb植植物物生生长长素素、细细胞胞分分裂裂素素：促促使使植植物物创创伤伤组组织织无无限制生长与分裂，形成冠瘿瘤。限制生长与分裂，形成冠瘿瘤。
11、冠冠瘿瘿碱碱：代代谢谢物物为为氨氨基基酸酸和和糖糖类类，是是根根癌癌农农杆杆菌菌生长必需的物质。生长必需的物质。：合成植物生长素、细胞分裂素；：合成植物生长素、细胞分裂素；Ti质粒的功能区：质粒的功能区：致瘤区致瘤区致瘤区致瘤区冠瘿碱合成区冠瘿碱合成区冠瘿碱合成区冠瘿碱合成区冠瘿碱代谢区冠瘿碱代谢区冠瘿碱代谢区冠瘿碱代谢区毒性区毒性区毒性区毒性区(Vir(Vir区区区区)：参与冠瘿碱合成；：参与冠瘿碱合成；：参与冠瘿碱合成；：参与冠瘿碱合成；：参与冠瘿碱分解；：参与冠瘿碱分解；：参与冠瘿碱分解；：参与冠瘿碱分解；：参与：参与：参与：参与T-DNAT-DNA转移、插入植物染色体。转移、插入植物染
12、色体。转移、插入植物染色体。转移、插入植物染色体。tmstmr tmt opine代谢区代谢区Vir区区Ti plasmidoriT-DNAleft borderright border乙酰丁香酸乙酰丁香酸植物根部植物根部羟基乙酰丁香酸羟基乙酰丁香酸COOHCH2OHCH3OCH3H3COCOOHOCH3H3CO 损损伤伤的的植植物物根根部部分分泌泌乙乙酰酰丁丁香香酸酸、羟羟基基乙乙酰酰丁丁香香酸酸，诱诱导导Ti质质粒粒上上的的vir基基因因、农农杆杆菌菌染色体上的一个操纵子表达。染色体上的一个操纵子表达。vir基基因因产产物物将将Ti质质粒粒上上的的T-DNA单单链链切切下下，操操纵纵子子表
13、表达达产产物物与与单单链链T-DNA结结合合成成复复合合物，后者转化植物根部细胞。物，后者转化植物根部细胞。T-DNA单链单链根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒质粒Vir产物产物Ti Ti 质粒致瘤的分子机制质粒致瘤的分子机制质粒致瘤的分子机制质粒致瘤的分子机制LBRBOpineVirTi质粒质粒T-DNAT-DNALBRB特异性核酸内切酶特异性核酸内切酶乙酰丁香酸、乙酰丁香酸、羟羟基基乙乙酰酰丁丁香香酸酸诱导表达诱导表达在在LB和和RB的第的第3、4个碱基之间切开个碱基之间切开单链单链T-DNA整合于植物基因组上整合于植物基因组上Ti 质粒的改造质粒的改造原原因因：大大量量的的生生长长素素和和分分
14、裂裂素素会会抑抑制制细细胞胞再再生生为整株植物。为整株植物。原原因因：冠冠瘿瘿碱碱的的合合成成大大量量消消耗耗精精氨氨酸酸、谷谷氨氨酸酸，影响植物细胞的生长。影响植物细胞的生长。1）除除去去T-DNA上上的的生生长长素素和和分分裂裂素素生生物物合合成成基因基因(tms和和tmr)。2）除去）除去T-DNA上的冠瘿碱生物合成基因上的冠瘿碱生物合成基因(tmt)。4）安安装装E.coli复复制制子子，使使其其能能在在E.coli中中复复制制，以以利于克隆操作。利于克隆操作。3）除除去去Ti质质粒粒上上的的其其它它非非必必需需序序列列，最最大大限限度度地地缩短载体长度。缩短载体长度。5）安安装装植植
15、物物细细胞胞筛筛选选标标记记（如如新新霉霉素素抗抗性性基基因因neor）、植物基因启动子、）、植物基因启动子、polyA化信号序列。化信号序列。6）安装）安装MCS，以利于外源基因的克隆。，以利于外源基因的克隆。共整合转化共整合转化共整合转化共整合转化程序程序程序程序E.coli质质 粒粒 上上的的重重组组T-DNA和和根根癌癌农农杆杆菌菌中中的的野野生生型型T-DNA之之间间的的同同源源重重组组率率不不高高，导导致致转转化化效效率率较低较低。重组重组将外源基因克隆在将外源基因克隆在将外源基因克隆在将外源基因克隆在大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌-农杆菌农杆菌农杆菌农杆菌穿梭质粒穿梭质粒穿梭质
16、粒穿梭质粒的的的的T-DNAT-DNA区；区；区；区；转化携带转化携带转化携带转化携带TiTi辅助质粒辅助质粒辅助质粒辅助质粒(只含只含只含只含virvir区、不含区、不含区、不含区、不含 T-DNA T-DNA区区区区)的农杆菌；的农杆菌；的农杆菌；的农杆菌；重组农杆菌重组农杆菌重组农杆菌重组农杆菌 感染植物细胞。感染植物细胞。感染植物细胞。感染植物细胞。二元整合转化程序二元整合转化程序二元整合转化程序二元整合转化程序重组农杆菌转化植物的方法：重组农杆菌转化植物的方法：叶盘法：叶盘法：共培养法：共培养法：用用重重组组农农杆杆菌菌感感染染叶叶片片外外植植体体并并短短期期共共培培养养，不不需需进
17、进行行原原生质体操作。生质体操作。把重组农杆菌、植物原生质体共培养。把重组农杆菌、植物原生质体共培养。芽在生根培养基上芽在生根培养基上 生根生根感染叶盘在感染叶盘在选择培养基上长出选择培养基上长出愈伤组织和芽愈伤组织和芽叶片消毒、切割叶盘叶片消毒、切割叶盘与重组农杆菌共培养与重组农杆菌共培养叶盘法的程序叶盘法的程序脱菌脱菌移植再生植株移植再生植株外外源源基基因因在在整整合合入入植植物物基基因因组组中中后后，不不发发生生修修饰改变（如基因重排）。饰改变（如基因重排）。构建的转基因植株再生效率高；构建的转基因植株再生效率高；农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒转化法的优点：质粒转化法的优点：成本低，转
18、化率高；成本低，转化率高；转入的外源基因拷贝数低，大多数为单拷贝。转入的外源基因拷贝数低，大多数为单拷贝。农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒转化法的缺点：质粒转化法的缺点：宿主局限性，主要用于双子叶植物的遗传转化。宿主局限性，主要用于双子叶植物的遗传转化。农农杆杆菌菌极极少少能能感感染染单单子子叶叶植植物物，一一些些重重要要的的农作物（如水稻、小麦、玉米等）对其不敏感农作物（如水稻、小麦、玉米等）对其不敏感。根根癌癌农农杆杆菌菌介介导导的的Ti质质粒粒转转化化法法是是目目前前转转基基因因植植物物最最常常用用的的方方法法，80%的的转基因植物是采用该方法获得的。转基因植物是采用该方法获得的。植植物
19、物病病毒毒广广泛泛存存在在，且且不不受受单单子子叶叶或或双双子子叶叶的的限限制制，因因此此以以病病毒毒作作为为植植物物基基因因工工程程载载体体日日益益受受到到重视。重视。在在300种种特特征征清清楚楚的的植植物物病病毒毒中中，单单链链RNA病病毒毒占占91%，双双链链RNA病病毒毒、双双链链DNA病病毒毒、单单链链DNA病毒各占病毒各占3%。2、植物病毒介导的转染、植物病毒介导的转染RNA操作困难，不适合作为克隆载体。操作困难，不适合作为克隆载体。花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)：双链：双链DNA病毒病毒双生病毒双生病毒(Geminivirus)：单链：单链DNA病毒病毒 两种常用的植
20、物病毒载体：两种常用的植物病毒载体：转染植物细胞原生质体转染植物细胞原生质体利用植物病毒载体转化植物细胞的利用植物病毒载体转化植物细胞的战略战略：转染植物组织转染植物组织 以以双双链链DNA病病毒毒花花椰椰菜菜花花叶叶病病毒毒(CaMV)基基因因组组为为载载体体，去去除除有有关关的的致致病病基基因因，换换上上外外源源基基因因，体体外外包包装装成成有有感感染染力力的的病病毒毒颗颗粒粒，转转染植物细胞原生质体，由此再生成整株植物。染植物细胞原生质体，由此再生成整株植物。1）转染植物细胞原生质体）转染植物细胞原生质体1）即即使使切切除除基基因因组组中中的的非非必必需需序序列列，其其承承载载外外源基因
21、的能力还是有限，只能插入很小的片段。源基因的能力还是有限，只能插入很小的片段。花椰菜花叶病毒载体：花椰菜花叶病毒载体：2）宿宿主主范范围围非非常常窄窄，主主要要是是芸芸苔苔属属植植物物，如如芜芜菁、甘蓝、花椰菜等。菁、甘蓝、花椰菜等。2）转染植物组织）转染植物组织 A链链能能单单独独在在植植物物细细胞胞中中复复制制，含含一一部部分分病病毒毒包包衣衣蛋蛋白白基基因因；B链链含含另另一一部部分分包包衣衣蛋蛋白白基基因因及及感感染染性性基基因因。A、B两两条条链链必必须须同同处处于于一一个个植植物物细细胞胞中中，方方能形成有感染力的病毒。能形成有感染力的病毒。植植物物双双生生病病毒毒(Geminiv
22、iruses)为为单单链链DNA病病毒毒，成成熟熟病病毒毒呈呈双双颗颗粒粒状状，每每个个颗颗粒粒中中含含一一条条不不同同的的DNA单链。单链。转染植物组织转染植物组织转染植物组织转染植物组织双双双双 生生生生 病病病病 毒毒毒毒 家家家家族族族族成成成成员员员员-番番番番茄茄茄茄金金金金 色色色色 花花花花 叶叶叶叶 病病病病毒毒毒毒(TGMV)(TGMV)表表表表达达达达 载载载载 体体体体 的的的的 构构构构建程序建程序建程序建程序 2）可可引引起起破破坏坏性性侵侵染染，需需严严格格防防护护，防防止止载载体体从宿主中逃逸，侵染自然中的植物。从宿主中逃逸，侵染自然中的植物。双生病毒载体：双生
23、病毒载体：1）宿宿主主范范围围广广，是是一一种种很很有有潜潜力力的的植植物物病病毒毒载载体，可体，可侵染重要的作物（如玉米、小麦）。侵染重要的作物（如玉米、小麦）。3、植物细胞的直接转化程序、植物细胞的直接转化程序基因枪转化法基因枪转化法电穿孔转化法电穿孔转化法激光微束穿孔法激光微束穿孔法多聚物介导法多聚物介导法花粉管通道法花粉管通道法基因枪转化法基因枪转化法 快快速速简简便便，不不受受宿宿主主范范围围限限制制，而而受受体体植植物物细细胞胞不不需需去去除除细细胞胞壁壁，被被转转化化的的细细胞胞或或组组织织容容易易再再生生成植株；但成本高，转化率低。成植株；但成本高，转化率低。所所有有涉涉及及植
24、植物物原原生生质质体体的的转转化化方方法法（农农杆杆菌菌介介导导法法、植植物物病病毒毒转转化化法法、电电穿穿孔孔法法、多多聚聚物物介介导导法法）均均存存在在一一个个难难题题：原原生生质质体体很很难难再再生生出出整整株植物株植物。4、植物原生质体的再生、植物原生质体的再生 原原生生质质体体的的再再生生效效率率在在植植物物转转基基因因技技术术中中至至关重要。关重要。植物原生质体的再生程序植物原生质体的再生程序1）将将植植物物嫩嫩叶叶、幼幼芽芽或或愈愈伤伤组组织织切切成成碎碎片片，浸浸入入含含纤纤维维素素酶酶的的缓缓冲冲液液中中保保温温，悬悬浮浮物物离离心心去去除细胞碎片。除细胞碎片。2）将将原原生
25、生体体悬悬浮浮液液滴滴在在无无菌菌滤滤纸纸片片上上，置置于于含含普普通通植植物物细细胞胞（滋滋养养细细胞胞）的的固固体体再再生生培培养养基表面。基表面。原原生生质质体体不不直直接接接接触触滋滋养养细细胞胞，但但可可吸吸收收其其分分泌泌扩扩散散的的植植物物生生长长因子及其它化合物。因子及其它化合物。3）培培养养2-3周周后后，将将滤滤纸纸上上的的植植物物细细胞胞蔟蔟转转移移至至含含高高浓浓度度分分裂裂素素、低低浓浓度度生生长长素素的的固固体体培培养养基基上上，继继续续培培育育2-4周周，滤滤纸纸片片上上便便长出嫩芽。长出嫩芽。4）将将嫩嫩芽芽置置于于含含低低浓浓度度生生长长素素、无无分分裂裂素素
26、的的固固体体培培养养基基上上，使使其根部发育。其根部发育。5）3周周后后，将将之之移移植植于于土土壤壤中中，长长成成整整株株植物。植物。农杆菌介导法、基因枪法回顾农杆菌介导法、基因枪法回顾新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neor）庆大霉素抗性基因（庆大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸转移酶基因（潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）膦丝菌素乙酰转移酶基因（膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）1）植物基因工程中的）植物基因工程中的选择标记选择标记：5、植物基因工程中的选择标记和报告基因、植物基因工程中的选择标记和报告基因-葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（gus）胭脂碱和章鱼碱胭脂碱和章鱼碱氯霉素乙酰
27、转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（cat）荧光素酶基因（荧光素酶基因（luc）绿色荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因（gfp）2）植物基因工程中的）植物基因工程中的报告基因报告基因：（四）高等植物的基因表达系统（四）高等植物的基因表达系统（四）高等植物的基因表达系统（四）高等植物的基因表达系统 花花椰椰菜菜花花叶叶病病毒毒CaMV的的35S启启动动子子能能在在许许多多植植物物物物种种、几几乎乎所所有有发发育育阶阶段段、所所有有组组织织中高效表达，被广泛用于构建转基因植株。中高效表达，被广泛用于构建转基因植株。启启动动子子是是决决定定基基因因表表达达部部位位、时时间间、强强度度的主要调控元件。的主要
28、调控元件。在在高高等等植植物物基基因因工工程程中中，外外源源基基因因的的时时空空特特异异性性表表达达尤尤为为重重要要，因因为为很很多多外外源源基基因因的的表表达达产产物物对对植植物物早早期期的的生生长长、发发育育有影响，甚至会致死植株。有影响，甚至会致死植株。高等植物的基因表达系统高等植物的基因表达系统高等植物的基因表达系统高等植物的基因表达系统外源基因的四环素诱导系统外源基因的四环素诱导系统外源基因的乙醇诱导系统外源基因的乙醇诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的类固醇诱导系统外源基因的类固醇诱导系统1、外源基因的四环素诱导系统、外源基因的四环素诱导系统Tc-
29、on型四环素诱导系统型四环素诱导系统CaMV 35S PPlant nos TGUStet操作子操作子显色反应显色反应四环素四环素CaMV 35S PPlant nos T -葡萄糖苷酸酶基因葡萄糖苷酸酶基因GUStet操作子操作子四环素诱导型报告基因表达盒四环素诱导型报告基因表达盒CaMV 35S PPlant nos TE.coli tetR四环素阻遏蛋白基因表达盒四环素阻遏蛋白基因表达盒TetRTc-off型四环素阻遏系统型四环素阻遏系统35S PPlant nos T GFPtet四环素四环素tTA融合蛋白融合蛋白DNA结合活性结合活性转录激活作用转录激活作用tTA激活因子表达盒激活因
30、子表达盒CaMV 35S PPlant nos TtetRVP1635S PPlant nos T绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因GFP四环素阻遏型报告基因表达盒四环素阻遏型报告基因表达盒7个个tet 操作子操作子嵌合启动子嵌合启动子Top102、外源基因的乙醇诱导系统、外源基因的乙醇诱导系统CaMV 35S PPlant nos T巢曲霉菌巢曲霉菌 alcR转录激活因子表达盒转录激活因子表达盒CaMV 35S PPlant nos T氯霉素乙酰转移酶基因氯霉素乙酰转移酶基因CAT乙醇诱导型报告基因表达盒乙醇诱导型报告基因表达盒alcA启动子控制区（启动子控制区（alcA编码乙醇降解酶）编码乙
31、醇降解酶）AlcRCaMV 35S PPlant nos TCAT乙醇乙醇氯霉素抗性氯霉素抗性3 3、外源基因的地塞米松诱导系统、外源基因的地塞米松诱导系统、外源基因的地塞米松诱导系统、外源基因的地塞米松诱导系统地塞米松诱导系统地塞米松诱导系统地塞米松诱导系统地塞米松诱导系统tTA激活因子表达盒激活因子表达盒Plant PPlant nos TGFPGal4 结合区结合区地塞米松地塞米松tTA融合蛋白融合蛋白CaMV 35S PPlant nos T转录因子转录因子Gal4转录激活因子转录激活因子VP16激素受体激素受体GRPlant PPlant nos T 绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因
32、 GFP地塞米松诱导型报告基因表达盒地塞米松诱导型报告基因表达盒Gal4 结合区结合区地塞米松诱导、四环素抑制型系统地塞米松诱导、四环素抑制型系统四环素四环素显色反应显色反应地塞米松地塞米松tetR:tet结合蛋白结合蛋白NLS:核定位信号序列核定位信号序列GR:激素受体激素受体VP16:转录激活因子转录激活因子GUS:-葡萄糖苷酸酶报告基因葡萄糖苷酸酶报告基因 35S PpAocs TVP16GRtetR NLSpA35S TGUS35S P7个个tet 操作子操作子4、外源基因的类固醇诱导系统、外源基因的类固醇诱导系统雌激素诱导型的外源基因表达系统雌激素诱导型的外源基因表达系统雌激素雌激素
33、PG10-90TE9hERlexA VP16TNOShptMCSPNOS OlexA P35ST3AXVE转录激活因子表达盒转录激活因子表达盒潮霉素标记基因表达盒潮霉素标记基因表达盒外源基因表达盒外源基因表达盒lexA：细菌：细菌lexA蛋白蛋白VP16：转录激活因子：转录激活因子MCS：多克隆位点：多克隆位点hER：人雌激素受体：人雌激素受体hpt：潮霉素磷酸转移酶基因：潮霉素磷酸转移酶基因 OlexA：LexA蛋白结合区蛋白结合区蜕皮激素诱导型的外源基因表达系统蜕皮激素诱导型的外源基因表达系统GRact：激素受体转录激活区：激素受体转录激活区 GR DBD：激素受体：激素受体DNA结合区结合区HEcR LBD：蜕皮激素受体的配体结合区：蜕皮激素受体的配体结合区 GRE：蜕皮激素受体结合序列：蜕皮激素受体结合序列 35S Pnos THEcR LBDGR DBDGRactVP16显色反应显色反应蜕皮激素蜕皮激素融合转录因子融合转录因子GUS35S Pnos T6个个GRE嵌合启动子嵌合启动子PES60融合激活因子表达盒融合激活因子表达盒蜕皮激素诱导型报告基因表达盒蜕皮激素诱导型报告基因表达盒