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1、病毒学检验病毒学检验本章内容本章内容第一节第一节 鸡胚接种技术鸡胚接种技术第二节第二节 动物接种技术动物接种技术第三节第三节 鸡鸡胚和动物接种技术胚和动物接种技术在在 病毒病毒检验中的应检验中的应用用1 1病毒学检验病毒学检验掌握掌握鸡胚接种途径及方法、病毒的检测鸡胚接种途径及方法、病毒的检测实验动物的种类、实验动物接种途径和接种方法实验动物的种类、实验动物接种途径和接种方法熟悉熟悉鸡胚孵育与检查、鸡胚接种所需实验材料与器械鸡胚孵育与检查、鸡胚接种所需实验材料与器械实验动物编号和分组、接种后的观察等实验动物编号和分组、接种后的观察等问题问题了解了解鸡胚的解剖与生理；鸡胚的解剖与生理；鸡胚和实验
2、动物接种技术在病毒检验中的应用鸡胚和实验动物接种技术在病毒检验中的应用2 2病毒学检验病毒学检验方法方法 应应 用用 价价 值值 存存 在在 问问 题题动物动物接种接种应用最早；应用最早；方法简便；方法简便；结果易于观察结果易于观察自身带病毒；自身带病毒；有的接种后不敏感；有的接种后不敏感；动物饲养问题动物饲养问题鸡胚鸡胚培养培养来源客观，易于管理，带病来源客观，易于管理，带病毒机会少；多途径接种毒机会少；多途径接种敏感病毒谱窄敏感病毒谱窄细胞细胞培养培养应用广泛，敏感病毒谱广应用广泛，敏感病毒谱广设备技术要求条件高设备技术要求条件高病毒分离培养常用方法病毒分离培养常用方法3 3病毒学检验病毒
3、学检验第一节第一节 鸡胚接种技术鸡胚接种技术病毒学检验病毒学检验概况概况1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次氏体。5 5病毒学检验病毒学检验鸡胚接种技术的鸡胚接种技术的优点优点鸡胚为一鸡胚为一整体整体，有神经血管的分布及脏器的构造；，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的鸡胚的组织分化程度低组织分化程度低，可选择适当途径接种，病，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒；毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒；来源充足，操作简单，通常是无
4、菌的，对接种的病来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。毒不产生抗体。6 6病毒学检验病毒学检验鸡胚接种技术的鸡胚接种技术的缺点缺点通常通常不产生特异性的感染指征不产生特异性的感染指征；食入的抗生素会传递给鸡胚，使病原体在鸡胚中食入的抗生素会传递给鸡胚，使病原体在鸡胚中的繁殖受到抑制；的繁殖受到抑制；某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚。某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚。7 7病毒学检验病毒学检验一、一、鸡胚的结构与生理鸡胚的结构与生理鸡胚是由鸡胚是由外胚层、外胚层、中胚层和内胚层中胚层和内胚层三个胚层发育起三个胚层发育起来的，它们共同来的，它们共同构成了胚胎的组构成
5、了胚胎的组织与器官。织与器官。卵白尿囊腔卵黄气室卵壳壳膜绒毛尿囊膜羊膜羊膜腔鸡胚胎911日龄鸡胚结构8 8病毒学检验病毒学检验9 9病毒学检验病毒学检验卵壳与壳膜卵壳位于最外层的坚硬壳层卵壳位于最外层的坚硬壳层壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换气室功能主要是呼吸和调节压力功能主要是呼吸和调节压力绒毛尿囊膜壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官羊膜胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。1010病毒学检验病毒学检验尿囊腔位于绒毛尿囊腔和羊膜之间位于绒毛尿囊腔和羊膜之间 ，胚胎排泄器官；含，
6、胚胎排泄器官；含5 520ml20ml尿囊液，含大量的尿酸盐尿囊液，含大量的尿酸盐卵黄囊主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养卵白外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养1111病毒学检验病毒学检验1212病毒学检验病毒学检验二、二、鸡胚的孵育和检查鸡胚的孵育和检查一、受精鸡卵的选择一、受精鸡卵的选择没有受到没有受到病毒和细菌病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病毒、布氏杆菌的污染如新城鸡瘟病毒、布氏杆菌等；等；培养立克次体和衣原体，不能来自食用培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗生素抗生素的鸡群。的鸡群。二、鸡胚的孵育二、鸡胚的孵育孵育的温
7、度孵育的温度 383839 39 孵育的湿度孵育的湿度 40407070 翻卵翻卵 每天每天180180转动鸡胚转动鸡胚1 12 2次次 通风通风 排出排出COCO2 2，吸入，吸入O O2 2 1313病毒学检验鸡卵鸡卵鸡卵鸡卵发育中的胚胎发育中的胚胎发育中的胚胎发育中的胚胎发育中的胚胎发育中的胚胎发育中的胚胎发育中的胚胎破壳而出的小鸡破壳而出的小鸡卵白卵白卵白卵白卵黄卵黄卵黄卵黄系带系带系带系带胚盘胚盘胚盘胚盘病毒学检验病毒学检验1515病毒学检验病毒学检验三、检卵三、检卵目的目的了解鸡胚的存活情况，标记了解鸡胚的存活情况，标记气室边界气室边界和和胚胎位置胚胎位置；观察接种后观察接种后胚胎
8、的状况胚胎的状况观察内容观察内容血管是否明显血管是否明显 有无胎动有无胎动 绒毛尿囊膜发育之界线绒毛尿囊膜发育之界线1616病毒学检验病毒学检验1717病毒学检验病毒学检验三、鸡胚的接种途径及方法三、鸡胚的接种途径及方法一、实验材料与器械一、实验材料与器械受精鸡卵受精鸡卵孵卵箱孵卵箱 检卵灯、照明灯、卵杯、卵盘、鸡胚开孔器检卵灯、照明灯、卵杯、卵盘、鸡胚开孔器其它器材其它器材1818病毒学检验病毒学检验二、接种途径与方法二、接种途径与方法羊膜腔接种：羊膜腔接种：主要用于临床材料（如患者咽漱液等）主要用于临床材料（如患者咽漱液等）分离分离流感病毒流感病毒。绒毛尿囊膜接种：绒毛尿囊膜接种：常用于常
9、用于牛痘病毒、天花病毒、单牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒纯疱疹病毒的分离；病毒滴定、中和试验。的分离；病毒滴定、中和试验。尿囊腔接种：尿囊腔接种：广泛应用于广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎流感病毒、流行性腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒病毒、新城鸡瘟病毒的适应和传代。的适应和传代。卵黄囊接种：卵黄囊接种：主要用于虫媒病毒、衣原体、立克次主要用于虫媒病毒、衣原体、立克次体等分离和繁殖；抗流感病毒药物实验。体等分离和繁殖；抗流感病毒药物实验。1919病毒学检验病毒学检验1 1、羊膜腔接种、羊膜腔接种分离分离流感病毒，流感病毒，收获羊水和尿囊液收获羊水和尿囊液。羊膜腔接种示意图羊膜腔接种示意图2020病毒
10、学检验病毒学检验n将将1012日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。n消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm6mm10mm6mm的长方形裂痕，的长方形裂痕，注意勿钻破壳膜。注意勿钻破壳膜。n再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。n将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊
11、膜腔内将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入O.1O.10.2ml0.2ml病毒液。病毒液。n拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封住，于住，于33333535孵育孵育484872h72h，要保持鸡胚钝端朝上。，要保持鸡胚钝端朝上。病毒学检验病毒学检验n收获前鸡胚须置收获前鸡胚须置44冰箱冰箱6h6h或过夜或过夜，但不能放置时间过长，但不能放置时间过长(过长会引起散黄过长会引起散黄)。如急于收获亦可置。
12、如急于收获亦可置-20-20冰箱冰箱lhlh左右。左右。n预冷的目的是，将预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。降。n病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。病毒学检验病毒学检验2 2、绒毛尿囊膜接种、绒毛尿囊膜接种牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离病毒的分离，可，可在
13、膜上可形成在膜上可形成斑点状或痘疱状病灶斑点状或痘疱状病灶。病毒滴定病毒滴定，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。的斑和痘的数目来计算。抗体滴定抗体滴定，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制。受到抑制。2323病毒学检验病毒学检验定位定位p将胎盘部分及自然气室将胎盘部分及自然气室部分用铅笔画出；部分用铅笔画出；p在在与胚胎略近气室端的与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育较好的绒毛尿囊膜发育较好的卵壳上划卵壳上划一直径约一直径约1cm的的等边三角形等边三角形卵窗2424病毒学检验病毒学检验绒毛尿囊膜接种示意图绒
14、毛尿囊膜接种示意图取卵壳；取卵壳；造人工气室；造人工气室；接种；接种；消毒；消毒；培养。培养。2525病毒学检验病毒学检验用用2.52.5的碘酒和的碘酒和7575的酒精分别消毒人工气室上的卵壳，的酒精分别消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的胶布。去除窗孔上的胶布。用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用5050甘油保甘油保存。同时作无菌培养。存。同时作无菌培养。解剖与收获解剖与收获2626病毒学检验病毒学检验3.3.尿囊腔接种尿囊腔接种流感病毒流感病毒、流行
15、性腮腺炎病毒流行性腮腺炎病毒和和新城疫病毒新城疫病毒的传的传代。代。尿囊腔接种示意图尿囊腔接种示意图2727病毒学检验病毒学检验1.1.照胚：照胚：取取911911日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置，日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置，标出气室底边，在标出气室底边，在无大血管处标出尿囊腔注射部位无大血管处标出尿囊腔注射部位无大血管处标出尿囊腔注射部位无大血管处标出尿囊腔注射部位。2828病毒学检验病毒学检验标记气室和胚胎位置标记气室和胚胎位置2929病毒学检验病毒学检验2.消毒消毒气室向上放置鸡胚于卵架上；气室向上放置鸡胚于卵架上；先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。先后用碘酊和
16、酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。3.打孔打孔在所标记注射部位用剪刀尖端打孔；在所标记注射部位用剪刀尖端打孔；注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。距气室底边距气室底边距气室底边距气室底边0.5cm 0.5cm 3030病毒学检验病毒学检验接种部位消毒接种部位消毒3131病毒学检验病毒学检验4.注入病毒材料注入病毒材料用用1mL1mL注射器抽取接种物；注射器抽取接种物；针头垂直刺入注射部位针头垂直刺入注射部位1-1.2cm1-1.2cm即达尿囊腔内；即达尿囊腔内；注入待接种的病毒液：接种量为注入待接种的病毒液：接种量为0.10.2mL0.10.2mL。
17、3232病毒学检验病毒学检验5.封孔封孔用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。6.孵育与观察孵育与观察气室朝上于气室朝上于3737温箱中孵育；温箱中孵育；以后每天检卵以后每天检卵1212次。次。弃去弃去24h24h内的死亡鸡胚：内的死亡鸡胚：机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。3333病毒学检验病毒学检验收集收集24h24h后死亡鸡胚，置后死亡鸡胚，置4 4冰箱过夜，以免收获时流血冰箱过夜，以免收获时流血;取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面；取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面；用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；用镊子击破气
18、室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液液液液，置无菌容器中保存备用。一般能尿囊液，置无菌容器中保存备用。一般能尿囊液6-10mL6-10mL。取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病理变取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。解剖与收获解剖与收获3434病毒学检验病毒学检验收获尿囊液收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液68ml3535病毒学检验病毒学检验4.4.卵黄囊接种卵黄囊接种用于用
19、于虫媒病毒虫媒病毒、衣原体衣原体及及立克次体立克次体等的分离和繁等的分离和繁殖。殖。卵黄囊接种示意图卵黄囊接种示意图3636病毒学检验病毒学检验四、病毒的检测四、病毒的检测（一）无菌试验（一）无菌试验目的：证实鸡胚收获物是否受到细菌的污染。目的：证实鸡胚收获物是否受到细菌的污染。方法：方法：将鸡胚组织或收获的第一滴液体接种无菌肉汤；将鸡胚组织或收获的第一滴液体接种无菌肉汤；3737培养培养36h36h。结果判定结果判定肉汤清亮透明，说明没有污染；肉汤清亮透明，说明没有污染；肉汤混浊，或有菌落出现，说明鸡胚被细菌污染。肉汤混浊，或有菌落出现，说明鸡胚被细菌污染。3737病毒学检验病毒学检验（二）
20、检测方法（二）检测方法直接观察法直接观察法绒毛尿囊膜上形成绒毛尿囊膜上形成损害或痘疱损害或痘疱：如痘类病毒和疱疹病毒。：如痘类病毒和疱疹病毒。引起引起鸡胚死亡鸡胚死亡：如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒。：如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒。造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓，如马流感病毒。造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓，如马流感病毒。实验检测法实验检测法血凝和血凝抑制试验血凝和血凝抑制试验：流感病毒：流感病毒补体结合试验：腮腺炎病毒补体结合试验：腮腺炎病毒其他：其他：PCRPCR等等3838病毒学检验病毒学检验3939病毒学检验病毒学检验第二节第二节 动物接种技术动物接种技术病毒学检验病毒学检验实验
21、动物（实验动物（experimental animalsexperimental animals）是指经是指经人工饲养人工饲养，遗传背景明确遗传背景明确、来源清楚，、来源清楚，控制其携控制其携带的微生物带的微生物，用于科学研究、教学、生产、鉴定，用于科学研究、教学、生产、鉴定以及其它科学实验的所有动物。以及其它科学实验的所有动物。4141病毒学检验病毒学检验发现发现年份年份发现人发现人所用动物所用动物血液循环血液循环1628哈维哈维蛙、蛇、鱼、蟹、其他蛙、蛇、鱼、蟹、其他醚麻醉醚麻醉1846玛登玛登鸟类、其他鸟类、其他细菌与疾病的关系细菌与疾病的关系1878科赫科赫牛、羊、其他牛、羊、其他细菌
22、致弱用免疫细菌致弱用免疫1880巴斯德巴斯德鸟类鸟类狂犬病免疫狂犬病免疫1885巴斯德巴斯德鸟类、家兔鸟类、家兔虫媒传播疾病虫媒传播疾病1898史密斯等史密斯等牛牛蚊传播疟疾蚊传播疟疾1898罗斯罗斯鸟类鸟类医学科学的重大发现与动物实验的关系医学科学的重大发现与动物实验的关系4242病毒学检验病毒学检验发现发现年份年份发现人发现人所用动物所用动物肿瘤的病毒病原肿瘤的病毒病原1910洛斯洛斯鸡鸡 胰岛素胰岛素1921班定班定狗狗休克治疗休克治疗1927博莱罗克博莱罗克狗狗抗细菌药物（百浪多息）抗细菌药物（百浪多息）1935多麦克多麦克小鼠小鼠 心肺旁道器心肺旁道器1953葛明葛明猫猫小儿麻痹症疫
23、苗小儿麻痹症疫苗1954索尔克索尔克恒河猴恒河猴变性脑病的病毒病原变性脑病的病毒病原1965格但斯克格但斯克猩猩猩猩心脏移植心脏移植1967伯纳德伯纳德狗狗医学科学的重大发现与动物实验的关系医学科学的重大发现与动物实验的关系4343病毒学检验病毒学检验 登革病毒对新生乳鼠的致病作用登革病毒对新生乳鼠的致病作用 1-3日龄乳鼠接种病毒日龄乳鼠接种病毒6日后，小鼠陆续日后，小鼠陆续 出现体弱、弓背、行动迟缓等症状。出现体弱、弓背、行动迟缓等症状。4444病毒学检验病毒学检验一、实验动物的种类和基本操作方法一、实验动物的种类和基本操作方法（一）实验动物的种类（一）实验动物的种类按微生物控制分类按微生
24、物控制分类普通动物（普通动物（CVCV）、清洁动物（）、清洁动物（CLCL）、无特定病原、无特定病原体动物（体动物（SPFSPF）、无菌动物（、无菌动物（GFGF）和悉生动物）和悉生动物（GNGN）按遗传学控制分类按遗传学控制分类近交系、封闭群、突变系、杂交群、转基因动物近交系、封闭群、突变系、杂交群、转基因动物4545病毒学检验病毒学检验按微生物学控制分类按微生物学控制分类1 1、普通动物普通动物一级动物，指不携带主要人兽共患病病原和动一级动物，指不携带主要人兽共患病病原和动物烈性传染病病原的动物。物烈性传染病病原的动物。实验结果不稳定；实验结果不稳定；仅供教学示范及仅供教学示范及 作为预备
25、试验。作为预备试验。4646病毒学检验病毒学检验2 2、清洁动物清洁动物二级动物，除不携带普通动物病原体外，要求二级动物，除不携带普通动物病原体外，要求 不携带对动物危害大、不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原对实验干扰大的病原体。体。适用于大多数教学和适用于大多数教学和科研实验科研实验。4747病毒学检验病毒学检验3 3、无特定病原体动物无特定病原体动物(SPF)(SPF)三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的病原体病原体外，还要求排除潜在感染或条件致病的外，还要求排除潜在感染或条件致病的病原体病原体。目前国际公认的目前国际公认的标准级别的实验动物
26、标准级别的实验动物。4848病毒学检验病毒学检验饲养管理：饲养管理：SPF动物必须饲养在温湿度衡定的空气净化动物必须饲养在温湿度衡定的空气净化的屏障系统中，实行严格的微生物控制。的屏障系统中，实行严格的微生物控制。4949病毒学检验病毒学检验4 4、无菌动物和悉生动物无菌动物和悉生动物四级动物。四级动物。无菌动物无菌动物要求现有的检测技术在动物体内外的任要求现有的检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何微生物和寄生虫何部位均检不出任何微生物和寄生虫。悉生动物又称悉生动物又称已知菌动物已知菌动物 ，是指在无菌动物体，是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物，必须饲养于内植入已知微生物的动物，必须
27、饲养于隔离系统隔离系统。5050病毒学检验病毒学检验无菌动物无菌动物饲养条件：无菌隔离器。饲养条件：无菌隔离器。第一代通过无菌手术剖腹取胎第一代通过无菌手术剖腹取胎,饲养在无菌隔离器内，饲养在无菌隔离器内，人工喂乳或保姆代养培育而成。人工喂乳或保姆代养培育而成。5151病毒学检验病毒学检验悉生动物悉生动物饲养条件：无菌隔离器。饲养条件：无菌隔离器。来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其体内来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其体内带有已知菌，可分为单菌动物、双菌动物和多菌动物。带有已知菌，可分为单菌动物、双菌动物和多菌动物。5252病毒学检验病毒学检验按遗传学控制分类按遗传学控制分类1
28、 1、近交系、近交系(inbred strain)(inbred strain)概念：又叫纯系，概念：又叫纯系，经过连续经过连续2020代以上代以上全同胞或全同胞或亲子交配亲子交配培育的动物品系。培育的动物品系。特点特点基因型相同，表现型一致；基因型相同，表现型一致；对外来刺激反应一致；对外来刺激反应一致；实验结果重复性好，可比性强。实验结果重复性好，可比性强。5353病毒学检验病毒学检验5454病毒学检验病毒学检验 常用近交系小鼠名称缩写常用近交系小鼠名称缩写品系名品系名 缩缩 写写 品系名品系名 缩缩 写写 AKR AK C57BL/10 B10 BALB/c C C57BR BR CBA
29、 CB DBA/1 D1 C3H C3 DBA/2 D2 C57L L HRS/J HR C57BL/6 B6 STS S 5555病毒学检验病毒学检验C3H/He系系BALB/c系系C57BL 5656病毒学检验病毒学检验2 2、封闭群、封闭群(closed colony)(closed colony)概念：也称远交群，概念：也称远交群，在不从其外部引入新个体在不从其外部引入新个体的条件下，以的条件下，以非近亲交配方式至少连续繁殖非近亲交配方式至少连续繁殖4 4代代以上以上生产的一个实验动物种群。生产的一个实验动物种群。特点特点群体遗传特异性相对稳定；群体遗传特异性相对稳定；个体间具有杂合性
30、，存在一定差异。个体间具有杂合性，存在一定差异。5757病毒学检验病毒学检验常用封闭群的啮齿类的实验动物常用封闭群的啮齿类的实验动物昆明（昆明（KM）小鼠）小鼠、NIHNIH小鼠、小鼠、LACA小鼠、小鼠、ICR小鼠、小鼠、Wistar大鼠大鼠、SD大鼠大鼠、Hartley豚鼠、豚鼠、大耳白兔和青紫蓝兔等。大耳白兔和青紫蓝兔等。KM小鼠小鼠青紫蓝兔青紫蓝兔Wistar大鼠大鼠5858病毒学检验病毒学检验3 3、突变系、突变系(mutant strain)(mutant strain)概念：由于概念：由于遗传基因发生突变遗传基因发生突变而具有某些特殊而具有某些特殊性状的动物，如肥胖症小鼠、糖尿病
31、小鼠等。性状的动物，如肥胖症小鼠、糖尿病小鼠等。BALB/cA-nu 1973年丹麦的年丹麦的C.W.Friis在在BALB/cA近交系小鼠近交系小鼠中发现自发性突变的无中发现自发性突变的无毛小鼠，该突变小鼠胸毛小鼠，该突变小鼠胸腺发育不良，免疫腺发育不良，免疫T细胞细胞缺失，而培育成了缺失，而培育成了BALB/cA-nu。5959病毒学检验病毒学检验突变系小鼠SCIDSCID小鼠小鼠小鼠小鼠裸小鼠裸小鼠裸小鼠裸小鼠6060病毒学检验病毒学检验4 4、杂交群、杂交群概念：又称异系杂交，是由概念：又称异系杂交，是由不同的品系杂交不同的品系杂交所所产生的后代。由两个近交系之间交配产生的动产生的后代
32、。由两个近交系之间交配产生的动物称为杂交一代。物称为杂交一代。特点：特点：杂交一代动物遗传和表型均一性好；杂交一代动物遗传和表型均一性好；生命力、适应力和抗病力较近交系动物强；生命力、适应力和抗病力较近交系动物强；实验结果重复性好，适应实验范围更大。实验结果重复性好，适应实验范围更大。6161病毒学检验病毒学检验繁殖方法：繁殖方法：将两个用于生产杂交一代的亲本将两个用于生产杂交一代的亲本品系或种群进行交配，所得第一代即为品系或种群进行交配，所得第一代即为F1F1动物。动物。6262病毒学检验病毒学检验5 5、转基因动物与基因缺陷动物、转基因动物与基因缺陷动物将将外源性基因插入外源性基因插入生殖
33、细胞基因组并能正常繁生殖细胞基因组并能正常繁衍的动物称为转基因动物。衍的动物称为转基因动物。采用采用基因剔除基因剔除技术构建基因缺陷动物，通过删技术构建基因缺陷动物，通过删减单一基因或相关基因组，研究基因的功能。减单一基因或相关基因组，研究基因的功能。6363病毒学检验病毒学检验二、常用实验动物二、常用实验动物6464病毒学检验病毒学检验（一）小鼠（一）小鼠近交系近交系BALB/cBALB/c、C3HC3H、DBADBA、C57BLC57BL、615615、129129等。等。突变系突变系nudenude、scidscid、dwdw、hrhr等。等。封闭群封闭群KMKM、ICRICR、NIHN
34、IH、CFWCFW等。等。6565病毒学检验病毒学检验 1、昆明小鼠(KM)远交群，基因库大，基因杂合率高。远交群，基因库大，基因杂合率高。6666病毒学检验病毒学检验2、BALB/c小鼠近交系，白化小鼠，血压较高。易患慢性肺炎。近交系，白化小鼠，血压较高。易患慢性肺炎。BALB/c白化白化6767病毒学检验病毒学检验3、裸鼠 先天性无胸腺的突变系小鼠。先天性无胸腺的突变系小鼠。裸鼠是肿瘤研究的常用模型，也可研究病毒感裸鼠是肿瘤研究的常用模型，也可研究病毒感染与特定免疫功能的关系。染与特定免疫功能的关系。6868病毒学检验病毒学检验4、SCID鼠(severecombinedimmunodef
35、iciency,SCID)(severecombinedimmunodeficiency,SCID)体液免疫和细胞免疫严重联合缺陷的突变系小鼠。体液免疫和细胞免疫严重联合缺陷的突变系小鼠。缺乏缺乏T和和B淋巴细胞免疫功能。淋巴细胞免疫功能。目前多用于病毒免疫学目前多用于病毒免疫学 和肿瘤学的研究。和肿瘤学的研究。6969病毒学检验病毒学检验（二）豚鼠（二）豚鼠 在免疫学和病毒学实验中豚鼠可制备补体和抗体在免疫学和病毒学实验中豚鼠可制备补体和抗体及提供红细胞做血吸附实验等。及提供红细胞做血吸附实验等。7070病毒学检验病毒学检验（三）家兔（三）家兔免疫学和病毒学实验中常用动物。免疫学和病毒学实验
36、中常用动物。免疫反应灵敏，血清量产生较多；对许多病毒和致免疫反应灵敏，血清量产生较多；对许多病毒和致病菌非常敏感，适用于各种微生物学的研究病菌非常敏感，适用于各种微生物学的研究新西兰兔新西兰兔青紫蓝兔青紫蓝兔大耳白兔大耳白兔7171病毒学检验病毒学检验三、实验动物常用基本操作技术三、实验动物常用基本操作技术（一）实验动物的捕捉和固定（一）实验动物的捕捉和固定小鼠小鼠7272病毒学检验病毒学检验先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉。7373病毒学检验病毒学检验 在鼠向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤。7474病毒学检验病毒学检验将鼠体置于左手心中，把后肢拉直。7575病
37、毒学检验病毒学检验以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。7676病毒学检验病毒学检验7777病毒学检验病毒学检验大鼠大鼠7878病毒学检验病毒学检验先用右手抓取大鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉。7979病毒学检验病毒学检验在鼠向前爬行时，用左手拇指和食指抓住大鼠的两耳和颈部皮肤。8080病毒学检验病毒学检验 以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。如果大鼠体积太大,可由第二个人协助固定后肢。8181病毒学检验病毒学检验8282病毒学检验病毒学检验豚鼠豚鼠8383病毒学检验病毒学检验先用手掌迅速扣住鼠背。8484病毒学检验病毒学检验抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，中指和无名指轻轻扣住胸廓。85
38、85病毒学检验病毒学检验抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，中指和无名指轻轻扣住胸廓。8686病毒学检验病毒学检验或像抓取大鼠一样抓住双耳和颈背部皮肤。8787病毒学检验病毒学检验另一只手托住臀部。8888病毒学检验病毒学检验家兔家兔8989病毒学检验病毒学检验按住兔子的双耳和颈背部。9090病毒学检验病毒学检验一只手抓住兔子双耳和颈背部的毛皮提起。9191病毒学检验病毒学检验然后另一只手托其臀部，让其体重的大部分集中在这一只手上。9292病毒学检验病毒学检验注意：注意：不能单纯抓双耳或抓提背腹部的毛皮。9393病毒学检验病毒学检验9494病毒学检验病毒学检验将兔子放入盒式固定器内；露出头部
39、。9595病毒学检验病毒学检验（二）实验动物编号和分组（二）实验动物编号和分组1 1、编号：、编号：区别实验组和对照组动物区别实验组和对照组动物打号法：适用于耳朵较大的动物打号法：适用于耳朵较大的动物针刺法：适用于大小鼠、豚鼠针刺法：适用于大小鼠、豚鼠染色法染色法打孔或剪缺口法打孔或剪缺口法9696病毒学检验病毒学检验染色法染色法3%-5%3%-5%苦味酸苦味酸溶液，可染溶液，可染成黄色。成黄色。0.5%0.5%中性红或品红中性红或品红溶液溶液,可染成红色。可染成红色。9797病毒学检验病毒学检验打孔或剪缺口法打孔或剪缺口法9898病毒学检验病毒学检验2 2、分组、分组分组应按分组应按随机分配
40、随机分配的原则。的原则。每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求统计学要求而定。而定。为了实验的科学性和客观性，实验中必须设置为了实验的科学性和客观性，实验中必须设置对照组对照组。9999病毒学检验病毒学检验（三）实验动物常用的麻醉方法（三）实验动物常用的麻醉方法 局部麻醉局部麻醉浸润麻醉：浸润麻醉：普鲁卡因普鲁卡因、利多卡因利多卡因全身麻醉全身麻醉乙醚吸入、乙醚吸入、戊巴比妥钠戊巴比妥钠、氨基甲酸乙酯氨基甲酸乙酯100100病毒学检验病毒学检验（四）实验动物接种途径和接种方法（四）实验动物接种途径和接种方法皮下接种皮下接种101101病毒学检
41、验病毒学检验腹腔接种腹腔接种102102病毒学检验病毒学检验 以一只手抓取和固定动物，使腹部向上，以及使鼠头稍朝下大约15度角（头低位）。103103病毒学检验病毒学检验用消毒酒精进行进针部位消毒。104104病毒学检验病毒学检验另一只手将注射器针头于左（或右）小腹部刺入皮下。105105病毒学检验病毒学检验静脉接种静脉接种106106病毒学检验病毒学检验将小鼠放进固定器里。107107病毒学检验病毒学检验露出尾巴。用4550的温水浸润尾部半分钟或用酒精擦拭使血管扩张和使表皮角质软化。108108病毒学检验病毒学检验 用食指和中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，大拇指再轻轻按住尾
42、部。109109病毒学检验病毒学检验右手持注射器，使针头与静脉平行（小于30度角），从尾下四分之一处（约距尾尖2-3厘米）处进针。110110病毒学检验病毒学检验将兔子放入固定架111111病毒学检验病毒学检验先拔去注射部位的被毛；用手指弹动或轻揉兔耳，使静脉充盈；用消毒酒精消毒注射部位。112112病毒学检验病毒学检验用一只手的食指和中指托住注射部位的耳缘，大拇指顺势按在耳上面固定住兔耳。113113病毒学检验病毒学检验另一只手持6号针头（连注射器）尽量从静脉的远端刺入。114114病毒学检验病毒学检验当针头有回流血时，移动拇指于针头上以固定针头。115115病毒学检验病毒学检验将药液以均匀
43、的速度注入；或以均匀的速度抽取血液。116116病毒学检验病毒学检验注射（采血）完毕，用消毒棉球（签）轻轻按住针眼，拔出针头。117117病毒学检验病毒学检验用消毒棉球（棉签）压迫针眼片刻止血。118118病毒学检验病毒学检验消化道接种消化道接种119119病毒学检验病毒学检验 右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿口腔顶壁和咽后壁徐徐插入食道。120120病毒学检验病毒学检验鼻腔接种鼻腔接种颅内接种颅内接种角膜接种角膜接种121121病毒学检验病毒学检验一般性观察一般性观察动物发病症状情况观察动物发病症状情况观察特殊检查特殊检查（一）接种后动物观察（一）接种后动物观察 122122病毒学检验
44、病毒学检验（二）实验动物的标本采集（二）实验动物的标本采集 大鼠、小鼠采血大鼠、小鼠采血剪尾采血剪尾采血眼眶采血眼眶采血颈静脉、颈动脉采血颈静脉、颈动脉采血采眼球采血采眼球采血123123病毒学检验病毒学检验124124病毒学检验病毒学检验豚鼠采血豚鼠采血耳缘切口采血耳缘切口采血 背中足静脉采血背中足静脉采血 心脏采血心脏采血 家兔采血家兔采血耳缘静脉采血耳缘静脉采血耳中央动脉采血耳中央动脉采血颈静脉采血颈静脉采血125125病毒学检验病毒学检验尿液采集尿液采集代谢笼法代谢笼法 导尿法导尿法穿刺膀胱法穿刺膀胱法反射排尿法反射排尿法腹水采集腹水采集胃液的采集胃液的采集胆汁的采集胆汁的采集胰液的采
45、集胰液的采集126126病毒学检验病毒学检验（三）实验动物的处理（三）实验动物的处理处死处死颈椎脱位法颈椎脱位法心脏取血法心脏取血法动静脉大量放血法动静脉大量放血法吸入法吸入法麻醉法麻醉法无害化处理无害化处理组织管理组织管理污水污水污物污物感染动物及有关材料感染动物及有关材料127127病毒学检验病毒学检验三、使用实验动物的基本原则三、使用实验动物的基本原则研究目的明确研究目的明确 动物选择原则动物选择原则replace(replace(替代替代)reduction(reduction(减少减少)refinement(refinement(优化优化)动物实验科研设计动物实验科研设计原则原则对照
46、原则对照原则重复原则重复原则随机原则随机原则128128病毒学检验病毒学检验接种物标本的制备和处理接种物标本的制备和处理 选择含病毒较多的材料作接种物。选择含病毒较多的材料作接种物。固体标本固体标本：病人、死者、野生动物及媒介昆虫等的原始病人、死者、野生动物及媒介昆虫等的原始标本。标本。液体标本液体标本：患者或动物的血液、脑脊液、尿液、水疱液患者或动物的血液、脑脊液、尿液、水疱液等标本。等标本。对于含菌标本：需用双抗处理，如鼻液、粪便等。对于含菌标本：需用双抗处理，如鼻液、粪便等。实验动物选择实验动物选择选择接种途径选择接种途径129129病毒学检验病毒学检验五、病毒学动物实验应注意的问题五、
47、病毒学动物实验应注意的问题 病毒学动物实验的安全问题病毒学动物实验的安全问题 实验动物自发性病毒感染对实验结果的影响实验动物自发性病毒感染对实验结果的影响 130130病毒学检验病毒学检验第三节第三节 鸡胚和动物接种技术的应鸡胚和动物接种技术的应用用病毒分离病毒分离病毒鉴定病毒鉴定病毒性疾病发病及免疫研究病毒性疾病发病及免疫研究抗病毒药物和病毒疫苗效果及安全性检测抗病毒药物和病毒疫苗效果及安全性检测疫苗的研制疫苗的研制131131病毒学检验病毒学检验病毒分离方法的比较病毒分离方法的比较方法方法 应应 用用 价价 值值 存存 在在 问问 题题动物接种动物接种应用最早；应用最早；方法简便；方法简便；结果易于观察结果易于观察自身带病毒；自身带病毒；有的接种后不敏感；有的接种后不敏感；动物饲养问题动物饲养问题鸡胚培养鸡胚培养 来源客观，易于管理，带来源客观，易于管理，带病毒机会少；多途径接种病毒机会少；多途径接种敏感病毒谱窄敏感病毒谱窄细胞培养细胞培养 应用广泛，敏感病毒谱广应用广泛，敏感病毒谱广设备技术要求条件高设备技术要求条件高132132病毒学检验病毒学检验The end133133