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1、PCR原理和基本操作过程2015.12.5临床146生化实验小组第一节 PCR技术原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)是一种DNA体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。PCR基本原理PCR基本反应步骤一、PCR的原理 PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据DNA的半保留复制，以及DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体
2、外人为地控制反应系统的温度，使双链DNA变性，成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。PCR三个基本反应步骤构成，即变性、退火、引物延伸。二、三个基本步骤变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不断向引物3端添加DNTP，DNA链不断延伸反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：
3、变性变性95度，退火度，退火55度，延伸度，延伸72度。度。1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95变变 性性第一轮扩增第一轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程
4、PCR的特点58引物1引物2DNA引物退退 火火PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶延延 伸伸PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50TaqTaqTaqTaq72PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万
5、个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌1.简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析2.对标本的纯度要求低1.血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR 的特点第二节PCR的实验步骤标准的PCR反应体系 10X 扩增缓冲液：5l 模板DNA:0.12g 引物：各0.21mol/L 4种dNTP:各200mol/L Mg2+:1.5mmol/L Taq DNA聚合酶：2.5UddH2O 补齐 总体积：50lu可以按照比例放大或者缩小体系，不同的可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应
6、需要优化反应需要优化u按照实验方案进行即可按照实验方案进行即可1.加样 将上述总体积为50l的反应体系加入一无菌0.5ml离心管中2离心 将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根据引物和扩增片段的大小而定）：94下加热4分钟左右；依次94变性1分钟，45退火1分钟，72延伸2分钟，循环32次左右；72下保温7分钟，使反应产物扩增充分4PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法PCR循环参数 94，3min；94，45s；58，1min；循环30次72，1min；72，10min；16 保温（热力学参数）（热力学参数）94，3min；94，45s；58，1min；循环30次72，1min；72，10min；16 保温 94 预变性，3min使DNA双链完全打开退火：58，1min 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。变性：94 变性，45s 使双链DNA解链为单链延伸：72，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 时间由扩增片段的长度决定 1min扩增1KB