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1、会计学1PCR的原理和操作过程的原理和操作过程第一节第一节 PCR技术原理技术原理 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)polymerase chain reation,PCR)是一种是一种DNADNA体外体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNADNA片片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNADNA供分供分析研究和检测鉴定。析研究和检测鉴定。PCRPCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、
2、技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。重复性好、易自动化等突出优点。n nPCR基本原理n nPCR基本反应步骤第1页/共18页一、PCR的原理 PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据DNA的半保留复制，以及DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度，使双链DNA变性，成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。PCR三个基本反应步骤构成，即变性、退火、引物延伸。第2页/共18页二
3、、三个基本步骤二、三个基本步骤变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不断向引物3端添加DNTP，DNA链不断延伸反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：变性变性95度，退火度，退火55度，延伸度，延伸72度。度。第3页/共18页1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复
4、性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第4页/共18页PCRPCR的基本原的基本原理理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95变变 性性第一轮扩增第一轮扩增第5页/共18页PCRPCR的基本原的基本原理理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点58引物1引物2DNA引物退退 火火
5、第6页/共18页PCRPCR的基本原的基本原理理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶延延 伸伸第7页/共18页PCRPCR的基本原的基本原理理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点第1轮结束95第2轮开始第8页/共18页PCR的基本的基本原理原理n nPCRPCR反反应应条件条件n nPCRPCR过过程程n nPCRPCR的特点的特点50TaqTaqTaqTaq72第9页/共18页PCRPCR的基本原的基本原理理n nPCRPCR反应条件反应条件n
6、 nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点72第2轮结束第10页/共18页PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增第11页/共18页PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽
7、液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR 的特点第12页/共18页第二节第二节PCR的实验步骤的实验步骤第13页/共18页标准的标准的PCR反应体系反应体系n n 1010X X 扩增缓冲液：扩增缓冲液：5l5ln n 模板模板DNA:0.12gDNA:0.12gn n 引物：引物：各各0.210.21mol/Lmol/Ln n 4 4种种dNTP:dNTP:各各200200mol/Lmol/Ln n Mg Mg2+2+:1.5mmol/L:1.5mmol/Ln n Taq DNA Taq DNA聚合酶：聚合酶：2.5 2.5U Un nddHddH2 2O O 补齐补齐 总体积：总体积
8、：5 50 0llu可以按照比例放大或者缩小体系，不同的可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化反应需要优化u按照实验方案进行即可按照实验方案进行即可第14页/共18页n n1.加样 将上述总体积为将上述总体积为5050l l的反应体系加入一无的反应体系加入一无菌菌0.5ml0.5ml离心管中离心管中n n2离心 将加入的反应物混合均匀后稍离心，加将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上入一滴矿物油覆盖于反应混合物上n n3扩增 在在PCRPCR仪上设置仪上设置PCRPCR反应参数（具体反应参数（具体数据根据引物和扩增片段的大小而定）：数据根据引物和扩增片
9、段的大小而定）：9494下加热下加热4 4分钟左右；依次分钟左右；依次9494变性变性1 1分钟，分钟，4545退火退火1 1分钟，分钟，7272延伸延伸2 2分钟，循环分钟，循环3232次左右；次左右；7272下保温下保温7 7分钟，使反应分钟，使反应产物扩增充分产物扩增充分n n4PCR扩增产物分析 PCRPCR产物是否为特异产物是否为特异性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。产物的分析，可依鉴定，才能得出正确的结论。产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法据研究对象和目的不同而采用不同的分
10、析方法第15页/共18页PCR循环参数 94，3min；94，45s；58，1min；循环30次72，1min；72，10min；16 保温（热力学参数）（热力学参数）第16页/共18页 94，3min；94，45s；58，1min；循环30次72，1min；72，10min；16 保温 94 94 预变性，预变性，预变性，预变性，3min3min使使使使DNADNA双链完全打双链完全打双链完全打双链完全打开开开开n n退火：退火：58 58，1min1min 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。敏性。变性：94 变性，45s 使双链DNA解链为单链延伸：72，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 时间由扩增片段的长度决定 1min扩增1KB 第17页/共18页