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1、 流流 式式 细细 胞胞 术术郭素娟郭素娟生殖生物学实验室生殖生物学实验室2018.6.82018.6.8第一节第一节 流式细胞术概述流式细胞术概述流式细胞术流式细胞术=流式细胞术（流式细胞术（Flow CytometryFlow Cytometry,简称简称FCMFCM）是一种可）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选体加以分选 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态
2、下，细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞术的特点流式细胞仪流式细胞仪 流式细胞仪流式细胞仪 是测量染色细胞标记物荧光强度是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、小、内部
3、结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗原等）、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。进行快速测量并可分类收集的高技术。BD LSR通过流式细胞仪我们可以得到以下信息通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 -相对细胞大小相对细胞大小 -相对细胞颗粒密度和内部复杂度相对细胞颗粒密度和内部复杂度 -染色过细胞的相对荧光强度染色过细胞的相对荧光强度细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA,RNADNA,RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子,PH,P
4、H值值,膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性基础研究基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（淋巴细胞功能、树突状细胞（DCDC）研究、造血干）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDRMDR）、肿瘤相关基因表达研究、）、肿瘤相关基因表达研究、RNARNA测定、测定、DNADNA测测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究血管内皮细胞研究临床研究
5、临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27HLA-B27分析、分析、PNHPNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、子测定、AIDSAIDS诊断与治疗和疗效评价、诊断与治疗和疗效评价、flow-FISHflow-FISH法测定端粒长度法测定端粒长度第二节第二节流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；效率；利用荧光染料与单克
6、隆抗体技术结合的标记技术，保证检利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。性。一、工作原理一、工作原理 基本工作原理基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程基本过程现代流式细胞仪包括现代流式细胞
7、仪包括液流系统液流系统 聚焦细胞以供检测光学系统光学系统 激发和收集光信号 电子系统电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析细胞分选系统细胞分选系统 由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的荧光染料标记的单抗对其染色单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进入从样品管进入流动室形成样本流流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而
8、阻塞喷孔。防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。1.液流系统液流系统液流系统液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处喷嘴喷嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系统示意图液流系统示意图FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长波长长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜
9、光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光），（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）2.2.光学系统光学系统FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图流式细胞仪的光信号流式细胞仪的光信号散射光信号散射光信号荧光信号荧光信号(2)散射光信号散射光信号前向角散射
10、光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（侧向角散射（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）入射激光入射激光9090 角的角的散射光信号散射光信号细胞粒度及细胞内相对细胞粒度及细胞内相对复杂性复杂性。前向角散射光前向角散射光 FSCFSCForward Angle Light ScatterFALS SensorLaser侧向角散射光侧向角散射光SSCSSCSide ScatterFALS Sensor90L
11、S SensorLaser散射光散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异的差异 -通常使用通常使用“散点图散点图”来看散射光信号来看散射光信号 -散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据的数据散点图散点图Dot PlotDot Plotlysed whole blood 测得的测得的FSFS与与SSSS信号信号通过计算机处理，可得通过计算机处理，可得到到FS-SSFS-SS图，由此可仅用图，由此可仅用散射光信号对未染色的散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的此为血
12、细胞分类的基本原理，但不能分析基本原理，但不能分析表面分子。表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不
13、同的光电倍增管。分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器（3）荧光测量）荧光测量荧光信号荧光信号荧光信号荧光信号=荧光素吸收激光能量荧光素吸收激光能量=荧光素将吸收能量释放，转换为荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子释放较入射光波长更长的光量子=荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光检测器荧光检测器Fl
14、uorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3,PMT4 etc.)主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成3.3.电子系统电子系统4.细胞分选系统细胞分选系统Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第三节第三节流式细胞术数据显示流式细胞术数据显示FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：
15、反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少 参参 数数单参数直方图单参数直方图双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析:REGION和和GATE设置设置数据显示方式数据显示方式双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式第四节第四节流式细胞样品制备流式细胞样品制备标本来源：标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他外周
16、血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他实验的不同，选用不同的抗凝剂。实验的不同，选用不同的抗凝剂。EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：枸椽酸钠：0.38%肝素：肝素：15IU/ml可选的抗凝剂有：可选的抗凝剂有：标本处理时间：标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：样本固定方法：1%1%的多聚甲醛或的多聚甲醛或75%75%的酒精，作用的酒精，作用3030分钟。分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。第五节第五节流式细胞荧光标记流式细胞荧光标记选择合适的荧光染料选择合适的荧光染料必须能够
17、被流式细胞仪上所配备的激光器所激发必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少荧光素光谱的重叠应当尽量减少抗体使用原则抗体使用原则根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体抗体低表达抗原标记高低表达抗原标记高S/NS/N（信噪比）荧光素，如（信噪比）荧光素，如PEPE、APCAPC使用双标以上抗体必做荧光补偿使用双标以上抗体必做荧光补偿FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PE
18、cy5FL1FL2FL3FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类几种常见的荧光染料几种常见的荧光染料名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结合易溶于水，与抗体结合不影响特异性不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产额稳定，偶联后量子产额低低藻红蛋白藻红蛋白PEPE48848
19、8橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消光具较多发光基团，消光系数和量子产额高系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料第六节第六节凋亡细胞的检测凋亡细胞的检测细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学及分子生物学性质的变化及分子生物学性质的变化,包括细胞皱缩包括细胞皱缩,核染核染色质凝聚色质凝聚,细胞膜通透性改变
20、细胞膜通透性改变,诱导蛋白酶凋亡诱导蛋白酶凋亡分子激活分子激活,线粒体跨膜电位降低线粒体跨膜电位降低,膜磷酯酰丝氨膜磷酯酰丝氨酸外化酸外化,胞质胞质Ca2+Ca2+浓度升高浓度升高,DNA,DNA片段化及含量片段化及含量变化等特点变化等特点,进行定性、定量测试分析进行定性、定量测试分析,从而实从而实现对细胞凋亡的准确测定。现对细胞凋亡的准确测定。Flow cytometry of apoptotic cell death细胞散射光 在细凋亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化Flow cytometry of apoptotic cell death荧光吸收细胞的胞膜对于D
21、NA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞Flow cytometry of apoptotic cell deathFCM of Caspases通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测 使用特异性的caspase-3荧光底物新的抗原决定基CK18Flow cytometry of apoptotic cell death线粒体功能的变化线粒体功能的变化 TMP会在凋亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123,DiOC6,JC-1,CMXRos等，
22、可作为流式检测的探针。当细胞发生凋亡时，一个线粒体膜表面蛋白7A6抗原会出现Bcl-2/bax family of proteins.Flow cytometry of apoptotic cell death钙离子流和钙离子流和 pHpH值变化值变化 胞浆内Ca2+水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。使用Ca2+选择性荧光探针，如 Quin-2,Fluo-3,Indo-1 通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH,BCECF,BCECF-AM,SNAFLs,SNARFs等进行检测
23、 Flow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid Phospholipid redistribution redistribution第七节第七节细胞周期的检测细胞周期的检测原理：细胞在有丝分裂的过程中原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA DNA 会加倍。会加倍。（n-2n-2n n）以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有细胞又有
24、 G1 G1 期，期，S S 期期,G2,G2 期和期和 M M 期。期。Flow cytometry of cell cycleG1 G1 期期细胞主要进行细胞主要进行 RNA RNA 和蛋白的合成和蛋白的合成,DNA,DNA 数数目为目为 n.n.S S 期期 DNA DNA 开始复制，直到复制结束进入开始复制，直到复制结束进入 M M 期，期，DNA DNA 数目从数目从 n n 变为变为 2n.2n.G2 G2 期期主要是主要是 RNA RNA 和蛋白的合成和蛋白的合成,为为 M M 期做准备期做准备 DNA DNA 数目为数目为 2n 2nM M 期期细胞分裂的过程，直到细胞分裂的过
25、程，直到 M M 结束细胞一分为二，结束细胞一分为二，DNA DNA 数目也是数目也是 2n 2n，分裂后期，分裂后期DNADNA数目变回数目变回n n。从从 DNA DNA 的数目上，我们可以将细胞周期分为的数目上，我们可以将细胞周期分为 G0/G1 G0/G1 期，期，s s 期，期，G2/M G2/M 期期Flow cytometry of cell cycle一般利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图一般利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，如果来表示，如果 G0/G1 G0/G1 期处于期处于 50 50 的位置，那么的位置，那么 G2/M G2/M 期处于期处于 100 100 的位置。期间的为的位置。期间的为 S S 期期Flow cytometry of cell cycleFlow cytometry of cell cycleTHANK YOU