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1、流式细胞术及其应用第一部分流式细胞术的一般介绍概念流式细胞术流式细胞术（FlowFlowCytometryCytometry，FCMFCM或或或或 FACSFACS）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。定群体加以分选的现代细胞
2、分析技术。定群体加以分选的现代细胞分析技术。定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪流式细胞仪（FlowFlowCytometerCytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。一种新型高科技仪器。一种新型高科技仪器。一
3、种新型高科技仪器。流式细胞仪特点单细胞悬液单细胞悬液或生物颗粒或生物颗粒 分析速度高分析速度高多参数多参数精度高精度高当代最先进的细当代最先进的细胞定量分析技术胞定量分析技术FACSCalibur特点：特点：光路调节系统固定光路调节系统固定自动化程度高自动化程度高操作简便操作简便使用寿命长使用寿命长配备配备1-21-2根激光根激光细胞分选速度慢，细胞分选速度慢，细胞分选速度慢，细胞分选速度慢，主要用于细胞分析主要用于细胞分析主要用于细胞分析主要用于细胞分析临床型（台式机）临床型（台式机）BDLSRFACSVantageDiVa科研型（大型机）特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选FACSAr
4、ia科研型特点：特点：特点：特点：分辨率高分辨率高分辨率高分辨率高选配多种波长和选配多种波长和选配多种波长和选配多种波长和类型激光器类型激光器类型激光器类型激光器可把感兴趣细胞可把感兴趣细胞可把感兴趣细胞可把感兴趣细胞分选到特定培养孔分选到特定培养孔分选到特定培养孔分选到特定培养孔或板上（或板上（或板上（或板上（4 4路和路和路和路和2424孔板）孔板）孔板）孔板）适用于高速分选适用于高速分选适用于高速分选适用于高速分选和多色分析和多色分析和多色分析和多色分析流式细胞仪检测范围细胞大小细胞大小细胞粒度细胞粒度细胞表面面积细胞表面面积核浆比例核浆比例DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNA
5、RNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研
6、究流式细胞仪的工作原理光学系统光学系统 激光光源激光光源 光收集系统光收集系统液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统电子系统电子系统 光电转换光电转换 数据处理系统数据处理系统细胞分选系统细胞分选系统激光光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50光收集系统：滤光片 光
7、收集系统：光电倍增管（光收集系统：光电倍增管（PMT）液流系统：流动室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系统液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱细胞分选系统Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector信号检测-散色光FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC(90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化全血细胞流式全血细胞流式FSC-SSC图图它反应细胞的
8、物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分信号检测-荧光信号自发荧光 特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失数据显示类型单参数直方图（Histogram）X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率二维等高图和密度图Pseudo 3D Plot3D Plot二维点图Dot Plot便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式光谱交叉Emission wavelength(nm)530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54
9、 colors-simultaneous collection两色以上荧光分析存在光谱交叉荧光补偿荧光补偿方法方法所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿抗体使用原则根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC使用双标以上抗体必做荧光补偿样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学分析继续培养流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构他们分子结构不同不同,激发光谱和发射光谱也各异激发光谱和发射光谱也各
10、异,选择荧光染料时必须选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩如氩离子气体激光管离子气体激光管,它的发射光波它的发射光波488m,488m,氦氖离子气体激氦氖离子气体激光管发射光波长光管发射光波长633m633m）。）。488m488m激光光源常用的荧光染料及他们的激发光和发射激光光源常用的荧光染料及他们的激发光和发射光波长分别是：光波长分别是：激发光波长激发光波长激发光波长激发光波长发射光峰值发射光峰值发射光峰值发射光峰值（mm）（mm）FITCFITC（异硫氰酸荧光素）（异硫氰酸荧光素）488525488525（绿）（绿）
11、PEPE（藻红蛋白）（藻红蛋白）488575488575（橙红）（橙红）PIPI（碘化丙啶）（碘化丙啶）488630488630（橙红）（橙红）ECDECD(藻红蛋白藻红蛋白-得克萨斯红得克萨斯红)488610488610（红）（红）CY5CY5（化青素）（化青素）488675488675（深红）（深红）PreCPPreCP(叶绿素蛋白叶绿素蛋白)488675488675（深红）（深红）第二部分流式细胞术在不同领域的应用细胞周期分析在细胞周期内在细胞周期内在细胞周期内在细胞周期内,DNA,DNA含量随细胞内时相发生周期性含量随细胞内时相发生周期性含量随细胞内时相发生周期性含量随细胞内时相发生周
12、期性变化。变化。变化。变化。正常情况下正常情况下正常情况下正常情况下,大多数细胞处于休止期大多数细胞处于休止期大多数细胞处于休止期大多数细胞处于休止期(Go),(Go),G1G1期细胞虽有期细胞虽有期细胞虽有期细胞虽有DNADNA合成，但合成，但合成，但合成，但DNADNA含量仍为含量仍为含量仍为含量仍为2N2N，为二倍体细胞为二倍体细胞为二倍体细胞为二倍体细胞,;,;处于活跃的处于活跃的处于活跃的处于活跃的DNADNA合成期合成期合成期合成期(S(S期期期期)的细胞的细胞的细胞的细胞DNADNA 含量为含量为含量为含量为2N-4N;2N-4N;正经历细胞分裂正经历细胞分裂正经历细胞分裂正经历
13、细胞分裂(G2/M(G2/M期期期期)的细胞含有最大量的的细胞含有最大量的的细胞含有最大量的的细胞含有最大量的DNA(4N)DNA(4N)。细胞经固定后用细胞经固定后用细胞经固定后用细胞经固定后用 PI(PI(碘化丙啶碘化丙啶碘化丙啶碘化丙啶)等荧光染料染色等荧光染料染色等荧光染料染色等荧光染料染色即可上机测定。即可上机测定。即可上机测定。即可上机测定。但标本需先经但标本需先经但标本需先经但标本需先经RNARNA酶处理以酶处理以酶处理以酶处理以排除排除排除排除RNARNA干扰干扰干扰干扰。样品制备 1000rpm51000rpm5分钟分钟收集收集2X102X106 6个细胞个细胞PBSPBS漂
14、洗漂洗 两次两次70%70%酒精酒精4 4度固定过夜度固定过夜收集固定的细胞收集固定的细胞PBSPBS漂洗漂洗0.5PBS0.5PBS悬浮细胞悬浮细胞10g/l10g/lRNaseARNaseA3737度消化度消化1 1小时小时过过300300目细胞筛目细胞筛（含（含1%Triton)1%Triton)，1000rpm51000rpm5分钟分钟离心离心两次两次混匀，室温混匀，室温静止静止5 5分钟分钟上机建立获取模式，获取数据（PIPI单染分析细胞周期，同时看凋亡）单染分析细胞周期，同时看凋亡）去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用数据分析圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡圈
15、门去除粘连体，分析细胞周期细胞凋亡分析1.细胞核的改变：细胞核的改变：2.由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。可染性发生改变。3.研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这可染性降低。许多学者把这种种DNA可染性的降低可染性的降低认为是认为是凋亡细胞的标志之一凋亡细胞的标志之一。2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光（FSC）与细胞的大小有关，侧散射光
16、（SSC）反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。AnnexinV-PE/7-AAD双染色法双阴：活细胞AnnexinV-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞7-AADd单阳：坏死细胞人外周血淋巴细胞亚群检测人外周血淋巴细胞亚群检测 T淋巴细胞T淋巴细胞检测淋巴细胞检测淋巴细胞CD4+T（Th)淋巴细胞检测淋巴细胞检测淋巴细胞CD4+CD8+Ts淋巴细胞检测淋巴细胞检测淋巴细胞CD8+B淋巴细胞检测淋巴细胞检测淋巴细胞B淋巴细胞淋巴细胞 NK细胞检测淋巴细胞NK细胞细胞结束语 流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。务于全社会。