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1、免疫组化过程基本技术一、蛋白酶消化技术n n目的：使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性升目的：使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性升高，以利于抗原抗体最大限度结合，增强特异性染色。高，以利于抗原抗体最大限度结合，增强特异性染色。n n 胰蛋白酶、胃蛋白酶是实验室中最常用的两种消化酶。胰蛋白酶、胃蛋白酶是实验室中最常用的两种消化酶。n n 消化时间因组织而异，一般为消化时间因组织而异，一般为5 53030分钟。分钟。n n 消化结束后要充分洗涤。消化结束后要充分洗涤。n n 1.0.1%1.0.1%胰蛋白酶：胰蛋白酶：n n 胰酶胰酶0.1g+0.1%cacl,0.1g+0.1%ca
2、cl,用用0.1mol/LNaOH0.1mol/LNaOH调调PHPH至至7.87.8，消，消化温度为室温或化温度为室温或3737，5 530min30min。n n 2.0.4%2.0.4%胃蛋白酶：胃蛋白酶：n n 胃蛋白酶胃蛋白酶0.4g+0.1mol/L Hcl 100mol0.4g+0.1mol/L Hcl 100mol。二、非特异性染色控制n n造成非特异性染色的原因：n n1.从组织方面分析：自发的荧光、内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、内源性生物素等；n n2.从试剂方面看：用于标记的酶和荧光不纯或标记过量等原因引起。n n消除非特异性染色的方法：n n 最常用的方法是再加第一抗体
3、前，先用制备第二抗体动物的非特异血清作用1030min,以封闭组织中带电荷的基团，避免与第一抗体非特异性结合。此外，如作免疫荧光染色时，可用0.01%0.05%伊文斯兰稀释荧光抗体；如作免疫酶组织化学染色时，再加一抗前先用0.3%3%的H2 2O2 2甲醇溶液处理切片530min.三、对照试验n n为了对染色结果作出正确为了对染色结果作出正确的判断，染色中用已知抗的判断，染色中用已知抗原为阳性的标本与带检测原为阳性的标本与带检测标本同时进行免疫组化染标本同时进行免疫组化染色，呈阳性反应者为阳性色，呈阳性反应者为阳性对照。对照。n n如果用确认不含已知抗原如果用确认不含已知抗原的标本作对照，染色
4、结果的标本作对照，染色结果为阴性者称阴性对照。为阴性者称阴性对照。n n除此之外，空白、替代、除此之外，空白、替代、吸收和抑制试验等也属于吸收和抑制试验等也属于阴性对照。阴性对照。n n 选择对照片举例选择对照片举例检测抗原检测抗原阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照KeratinKeratin正常鳞状上皮正常鳞状上皮淋巴结淋巴结分化型鳞癌分化型鳞癌平滑肌瘤平滑肌瘤S-100S-100神经纤维神经纤维平滑肌瘤平滑肌瘤神经鞘瘤神经鞘瘤鳞癌鳞癌/腺癌腺癌CEACEA分化性胃癌分化性胃癌淋巴结淋巴结未分化胃癌未分化胃癌软组织肿瘤软组织肿瘤n n当染色结果所显示的是阳性对照片呈阳性、阴性当染色结果所显示的
5、是阳性对照片呈阳性、阴性对照片呈阴性时，表明被检测切片的标记结果正对照片呈阴性时，表明被检测切片的标记结果正确可靠。确可靠。标本号标本号 检测标本检测标本 阳性对照阳性对照 阴性对照阴性对照 替代抗原对照替代抗原对照 结论结论1 1+-含抗原含抗原2 2-+-不含抗原不含抗原3 3-操作错误操作错误4 4+非特异反非特异反应应5 5+-+非特异反非特异反应应6 6+-阳性对照阳性对照差差四、抗体的分装、稀释、滴加及保存四、抗体的分装、稀释、滴加及保存n n1.1.抗体的分装抗体的分装n n目的：将一次不能使用完的抗体根据用量进行分装。目的：将一次不能使用完的抗体根据用量进行分装。n n分装后的
6、抗体宜保存在分装后的抗体宜保存在-20-20-40-40的低温冰箱中，一般数年的低温冰箱中，一般数年有效。有效。n n分装后的抗体尽量一次用完，避免反复冻融而使抗体效价分装后的抗体尽量一次用完，避免反复冻融而使抗体效价降低。降低。n n2.2.抗体的稀释抗体的稀释 n n 抗原抗体的结合除了与它们之间的特异性外，还与两者抗原抗体的结合除了与它们之间的特异性外，还与两者之间的分子比例密切相关。如果抗体分子过多，阳性反应之间的分子比例密切相关。如果抗体分子过多，阳性反应减弱甚至出现假阴性。减弱甚至出现假阴性。n n（1 1）影响抗体稀释度的因素）影响抗体稀释度的因素n n1 1）抗体的浓度：抗体浓
7、度越高稀释度就越高。）抗体的浓度：抗体浓度越高稀释度就越高。n n2 2）抗体中的非特异蛋白的含量：）抗体中的非特异蛋白的含量：n n3 3）孵育时间：适当延长可提高抗体的稀释度。）孵育时间：适当延长可提高抗体的稀释度。n n4 4）染色方法：不同染色方法的灵敏度有别，其抗）染色方法：不同染色方法的灵敏度有别，其抗体的稀释度也不一样，如间接法较直接发灵敏；体的稀释度也不一样，如间接法较直接发灵敏；ABCABC法较法较PAPPAP灵敏。灵敏。n n 灵敏度越大抗体的稀释度可随之提高。灵敏度越大抗体的稀释度可随之提高。n n（2 2）抗体稀释度的测定方法：）抗体稀释度的测定方法：n n 为准确了解
8、抗体的稀释度，常将抗体按不同浓度为准确了解抗体的稀释度，常将抗体按不同浓度稀释，对已知抗原为阳性的切片进行染色，并将特稀释，对已知抗原为阳性的切片进行染色，并将特异性染色与背景染色的强弱以异性染色与背景染色的强弱以“+”“+”的多少表示，测的多少表示，测定方法有以下两种：定方法有以下两种：n n1 1）直接测定法）直接测定法 在其他条件已知的情况下将一抗在其他条件已知的情况下将一抗按按1 1：5050、1 1：100100、1 1：200200、1:4001:400、1 1：500500等浓等浓度稀释，分别滴加在切片上染色，同时设定阴、阳度稀释，分别滴加在切片上染色，同时设定阴、阳性对照，染色
9、结果可用下表表示。性对照，染色结果可用下表表示。一抗稀释度一抗稀释度 特异性染色特异性染色 非特异性染色非特异性染色1 1：50 +50 +1:100 +1:100 +1:200 +1:200 +1:400 +1:400 +1:500 +1:500 +阴性对照阴性对照 一抗最佳稀释度直接测定法一抗最佳稀释度直接测定法从表中可以看出，当一抗稀释到从表中可以看出，当一抗稀释到1 1：400400时染色呈强阳时染色呈强阳性，背景染色少。性，背景染色少。n n2）棋盘测定法n n 当对一抗、二抗或三抗的最佳稀释度都未知时，就必须采用此法进行测定。n n 在实际工作中，试剂公司所售抗体均已标明该抗体的稀
10、释度。n n（3）抗体的稀释方法n n 常用0.01mol/L PBS或TBS缓冲液即可。如稀释后的抗体需长时间保存，则另有配制方法：明胶+TBS+牛血清+NaN3 3，4度保存。n n3.3.滴加抗体的方法滴加抗体的方法n n 免疫组化染色时，再不使组织干燥的前提下，免疫组化染色时，再不使组织干燥的前提下，切片上所滴加抗体溶液应以充分覆盖组织切片为切片上所滴加抗体溶液应以充分覆盖组织切片为准，一般用微量加样器加准，一般用微量加样器加3030 50l50l即可。加液前即可。加液前常用蜡笔或特制免疫组化笔在组织周围画一个圈，常用蜡笔或特制免疫组化笔在组织周围画一个圈，以阻止溶液扩散。以阻止溶液扩
11、散。n n4.4.抗体的保存及与有效期抗体的保存及与有效期n n（五）孵育方法及时间（五）孵育方法及时间n n 抗体的孵育应在特质的湿盒中进行，以免切片因抗体的孵育应在特质的湿盒中进行，以免切片因水分蒸发而干燥、使染色失散。水分蒸发而干燥、使染色失散。n n 孵育时间常为一小时左右，温度为室温或孵育时间常为一小时左右，温度为室温或3737.孵育时间也可根据抗体的效价及检测方法的灵敏孵育时间也可根据抗体的效价及检测方法的灵敏度进行适当的延长或缩短，延长孵育时常在度进行适当的延长或缩短，延长孵育时常在4 4冰冰箱过夜。箱过夜。n n（六）切片的洗涤（六）切片的洗涤n n 滴加抗提前应用滴加抗提前应
12、用0.01mol/LPBS0.01mol/LPBS充分洗涤切片，充分洗涤切片，可浸洗或淋洗，每次可浸洗或淋洗，每次10min,10min,共共3 3次。次。n n（七）显色（七）显色n n 显色是免疫酶组织化学方法的步骤之一，将配制显色是免疫酶组织化学方法的步骤之一，将配制好的显色液滴加在切片上，通过酶的催化作用使好的显色液滴加在切片上，通过酶的催化作用使显色液中的底物产生着色沉淀。光镜下观察显色显色液中的底物产生着色沉淀。光镜下观察显色效果，以控制染色时间，一般室温下显色效果，以控制染色时间，一般室温下显色5 515min15min即可。不同的酶所用底物不同，常在显色即可。不同的酶所用底物不
13、同，常在显色前临时用缓冲液配制。前临时用缓冲液配制。n n 1.1.辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）显色液的配制：）显色液的配制：n n HRP+DAB+H HRP+DAB+H2 2O O2 2（二氨基联苯胺）（二氨基联苯胺）=显色（棕显色（棕黄）黄）n n 用硫酸氨镍或锇酸处理可使用硫酸氨镍或锇酸处理可使DABDAB的显色加深。的显色加深。n nDABH2O2DABH2O2的配制的配制n n1.1.在在5mol 0.05mol PH7.6 TrisHCl5mol 0.05mol PH7.6 TrisHCl中加入中加入2mg DAB2mg DAB反复吹反复吹打，使打，使DABDA
14、B充分溶解；充分溶解；n n2.0.5%H2O2 2.0.5%H2O2 取取30%30%的的H2O2 100lH2O2 100l，加蒸馏水，加蒸馏水6mol6mol，充，充分混匀、密封。分混匀、密封。n n3.3.临用前在临用前在DABDAB液中加入液中加入0.5%H2O2 0.5%H2O2 混匀后立即使用。混匀后立即使用。n n(八)染色结果的判断n n 在完成免疫组化染色后，对标记结果的判断关系到诊断的正确与否。理想的免疫组化染色结果阳性反应部位明显，且背景清晰。n n 根据抗原的分布部位不同，阳性染色可能显示在细胞内外，其中以细胞质为主。n n 阳性细胞的标准是阳性颗粒随抗原分布；且细胞
15、边界清楚，核结构清晰。n n 如果细胞之间染色强度相同，提示可能为非特异如果细胞之间染色强度相同，提示可能为非特异性染色。性染色。n n 边缘效应边缘效应在石蜡切片的组织周围常有深染区，在石蜡切片的组织周围常有深染区，向中心逐渐变淡，此现象为非特异性染色。类似向中心逐渐变淡，此现象为非特异性染色。类似的现象在刀痕、折叠、坏死、受挤压区域出现。的现象在刀痕、折叠、坏死、受挤压区域出现。n n（九）衬染（九）衬染n n 在免疫组化染色后，如再用其他燃料对切片进行在免疫组化染色后，如再用其他燃料对切片进行复染，则能衬托出组织的形态结构以利于对结果复染，则能衬托出组织的形态结构以利于对结果的分析。的分
16、析。n n 常用的衬染剂有苏木素、甲基绿、核固红等，究常用的衬染剂有苏木素、甲基绿、核固红等，究竟采用哪种燃料，应根据所用的免疫组织化学染竟采用哪种燃料，应根据所用的免疫组织化学染色方法，以及所呈现的颜色确定。如阳性染色为色方法，以及所呈现的颜色确定。如阳性染色为红色或棕色，则苏木素将细胞核染成蓝色。红色或棕色，则苏木素将细胞核染成蓝色。n n（十）切片的脱水、透明、封固n n 染色后的组织切片，须脱去组织中的水分使组织的折光率提高，这一过程谓透明。但为了减少脱片，透明的时间可适当缩短。n n方法：梯度脱水酒精+二甲苯（丙酮）n n(o)某些易溶于酒精的阳性产物，则不能用酒精脱水。依据脱水透明原理可选用其它脱水剂，或直接烘干+二甲苯透明。n n 树胶是常用的封片剂。谢谢！