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1、实验一实验一 鸡胚接种鸡胚接种病毒培养的宿主系统：病毒培养的宿主系统：本动物本动物实验动物：家兔、小实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、白鼠、大白鼠、豚鼠、鸡胚鸡胚体外培养的器官、组体外培养的器官、组织细胞织细胞一、实验目的一、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚接种方法。的鸡胚接种方法。二、原理二、原理 鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。二、材料二、材料1
2、.1.鸡胚鸡胚 1010日龄日龄2.2.病毒病毒 鸡新城疫病毒（鸡新城疫病毒（NDVNDV）3.3.照蛋灯照蛋灯4.4.打孔器打孔器5.5.石蜡石蜡6.6.注射器注射器7.7.蛋座蛋座8.8.酒精棉球、碘酊棉球酒精棉球、碘酊棉球三、鸡胚的结构与功能三、鸡胚的结构与功能1.1.卵壳卵壳 上有细孔，进行气体交换上有细孔，进行气体交换2.2.壳膜壳膜 使气体分子和液体分子在内使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。外两方面进行交换。3.3.气室气室 呼吸和调节压力呼吸和调节压力4.4.绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 起胚胎呼吸器官的起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内功能，氧气的交换是在膜的血管内
3、通过卵壳孔而进行的。通过卵壳孔而进行的。5.5.尿囊腔尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-1312-13天后，尿囊液开始变得混浊。天后，尿囊液开始变得混浊。6 6、6.6.羊膜与羊膜腔羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸其中盛有羊水，胎体浸泡于其中泡于其中7.7.卵黄卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。在胚胎发育早期供给鸡胚营养。8.8.卵白卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。四、受精卵的选择
4、四、受精卵的选择1.1.最好是来自最好是来自SPFSPF鸡群，以降低母源抗体鸡群，以降低母源抗体的影响的影响2.2.受精卵的壳最好是白色的受精卵的壳最好是白色的3.3.受精卵必须新鲜，保存在受精卵必须新鲜，保存在5-205-20不要不要超过超过1010天，保存一个月的受精卵，孵天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。化率将近于零。五、孵育五、孵育1.1.孵卵箱内的温度应保持在孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.537.5-38.52.2.相对湿度：相对湿度：50%-60%50%-60%3.3.必须保证具有充必须保证具有充分的新鲜空气流分的新鲜空气流通，特别是在孵通，特别是在孵化化5-65-6
5、天以后。天以后。4.4.从孵育后第从孵育后第3 3天开天开始，每天翻卵一始，每天翻卵一次。次。自孵育后的第自孵育后的第自孵育后的第自孵育后的第4 4 4 4天开天开天开天开始检卵，每天一次。始检卵，每天一次。始检卵，每天一次。始检卵，每天一次。孵育孵育孵育孵育4-54-54-54-5日后即可于日后即可于日后即可于日后即可于检卵灯上检查鸡胚受精与检卵灯上检查鸡胚受精与检卵灯上检查鸡胚受精与检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。否及发育情况。否及发育情况。否及发育情况。未受精卵未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹。血管和鸡胚痕迹。活胚：活胚：具有清晰的血管和鸡胚
6、暗影，较具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育大鸡胚还可见到胚动，但孵育1414、1515天天以后胎动不明显，甚至无胎动。以后胎动不明显，甚至无胎动。死胚：死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。血管昏暗模糊，没有胚动。六、六、检卵检卵七、接种前处理七、接种前处理1.1.用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。要接种的部位做好记号。2.2.对鸡胚进行消毒对鸡胚进行消毒八、接种途径八、接种途径1.1.绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种2.2.尿囊腔接种尿囊腔接种3.3.卵黄囊接种卵黄囊接种4.4
7、.静脉接种静脉接种 蓝舌病毒蓝舌病毒5.5.羊膜腔接种羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒正粘病毒和副粘病毒6.6.脑内接种脑内接种 狂犬病毒狂犬病毒7.7.眼球接种眼球接种（一）卵黄囊接种法（一）卵黄囊接种法 主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。方法一：方法一：1.1.取取取取6-86-86-86-8日龄鸡胚，用检卵灯日龄鸡胚，用检卵灯日龄鸡胚，用检卵灯日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，照视画出气室和胚胎位置后，照视画出气室和胚胎位置后，照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上垂直放置在卵座上垂
8、直放置在卵座上垂直放置在卵座上(大头向大头向大头向大头向上上上上)2.2.用碘酊和酒精消毒气室端用碘酊和酒精消毒气室端用碘酊和酒精消毒气室端用碘酊和酒精消毒气室端3.3.用钢锥在气室中央锥一小孔。用钢锥在气室中央锥一小孔。用钢锥在气室中央锥一小孔。用钢锥在气室中央锥一小孔。4.4.用注射器吸取病毒悬液，沿气室用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入端所穿小孔垂直刺入3cm3cm，注入，注入病毒液。病毒液。5.5.用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，每天翻卵继续孵育，每天翻卵1-21-2次，次，24h24h内死亡者废弃。内死亡者废弃。方法二：方法二：1.2.1
9、.2.同方法一同方法一5.5.用熔化的石蜡封孔，用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，置孵卵箱内继续孵育，24h24h内死亡者废弃。内死亡者废弃。3.3.将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的径的1/21/2处用碘酊和酒精消毒。处用碘酊和酒精消毒。4.4.用钢锥打一小孔，将针头刺入约用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm1.5cm，注，注入病毒液入病毒液。（二）绒毛尿囊膜接种（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘主要用于痘V V和疱疹和疱疹V V的分离和增殖。的分离和增殖。方法一：方法一：1.1.取取10-1210-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒。日龄鸡胚，
10、画出气室部，消毒。2.2.在气室端的卵壳上开一在气室端的卵壳上开一1.51.5cm1.51.5cm的口的口3.3.用灭菌眼科镊子撕去一用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜小片内壳膜4.4.滴入接种物滴入接种物5.5.用胶布或透明胶纸封闭用胶布或透明胶纸封闭切口切口方法二：（做人工气室）方法二：（做人工气室）1.1.在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm3-4mm的烤的烤焦圈。焦圈。2.2.用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。造成卵窗。3.3
11、.在气室端中央钻一个小孔。在气室端中央钻一个小孔。4.4.用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。5.5.用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。于壳膜上的生理盐水迅速渗入。6.6.用用1ml1ml注射器滴注射器滴2-32-3滴接种物于绒毛尿囊滴接种物于绒毛尿囊膜上。膜上。7.7.用透明胶纸封住
12、卵窗，或用玻璃纸盖于用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。室中央的小孔用石蜡密封。8.8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。向上。（三）（三）尿囊腔接种尿囊腔接种 主要用于正粘主要用于正粘V V和副粘和副粘V V，如流感，如流感V V、新城疫、新城疫V V的分离和增殖。的分离和增殖。1.1.选用选用10-1110-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位日龄的鸡胚，画出气室和胚位2.2.在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒3.3.用钢锥穿一小
13、孔用钢锥穿一小孔4.4.将注射器沿小孔插入将注射器沿小孔插入，注入注入0.1-0.2ml 0.1-0.2ml 接种接种物物5.5.用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，每天翻卵并检卵一次，24h24h内死亡内死亡者废弃。者废弃。九、九、NDVNDV接种鸡胚后对鸡胚的影响接种鸡胚后对鸡胚的影响 尿囊腔接种尿囊腔接种9-109-10日龄鸡胚日龄鸡胚 强毒株在接种后强毒株在接种后30-60h30-60h死亡，弱毒株死亡，弱毒株3-6d3-6d死亡。以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，死亡。以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足趾、翅膀出血最为明显。以头部
14、、足趾、翅膀出血最为明显。十、收毒十、收毒 收毒前将鸡胚直立放置于收毒前将鸡胚直立放置于44冰箱半小时以冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。上，冻死胚胎，防止出血。根据接种途径的不同，收获相应的材料根据接种途径的不同，收获相应的材料1.1.绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜收获接种部位绒毛尿囊膜2.2.尿囊腔接种尿囊腔接种 收获尿囊液（收获尿囊液（5-8ml5-8ml）3.3.卵黄囊接种卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体收获卵黄囊或胚体4.4.羊膜腔接种羊膜腔接种 收获羊水（收获羊水（0.5-1ml0.5-1ml）十一、试验报告作业十一、试验报告作业1.1.常用的鸡胚接种方法有哪些常用的鸡胚接种方法有哪些?2.2.简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。3.3.用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题?4.4.如何区分无精卵、死胚、活胚？如何区分无精卵、死胚、活胚？5.5.用于病毒培养的系统主要有哪些？用于病毒培养的系统主要有哪些？