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1、分子诊断技术常见的核酸分子诊断技术pp核酸分子杂交核酸分子杂交 (Nucleic acid molecular Hybridization)(Nucleic acid molecular Hybridization)pp基因芯片基因芯片（Gene Chip Gene Chip）pp聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction(polymerase chain reaction reactionreaction；PCR)PCR)核酸分子杂交的原理核酸分子杂交的原理l l双链核酸加热或经硷处理变性后，可解链成两条互补的单链核酸。l l在适当温度、盐浓度下，双链能按硷
2、基互补配对原则(A-T,C-G)复性而重新成为双链核酸。l l用已知序列的单链核酸，经标记制成核酸探针，与变性后的待测标本核酸进行杂交，通过检测标记探针的信号，可判断标本是否存在与探针互补杂交的同源核酸。核酸分子杂交探针的制备核酸分子杂交探针的制备制备探针的靶核酸可通过:l l分离、切割病毒的特定核酸片段获得;l l用重组技术，将该片段克隆到细菌质粒，经扩增和纯化大量获得;l l选择已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其长度以20个左右最为常用，过短易出现非特异性杂交。核酸分子杂交探针的制备核酸分子杂交探针的制备常见的用于标记探针的示踪物质l l放射性核素如：32P，35S，3H，
3、125I等，杂交后可通过放射自显影技术进行检测l l非放射性物质如：生物素、地高辛和酶等，杂交后可通过底物显色、化学发光等技术进行检测核酸分子杂交示意图核酸分子杂交示意图 核酸分子杂交的核酸分子杂交的程序程序 常用的核酸分子杂交技术常用的核酸分子杂交技术n n斑点杂交（spot blot hybridizationspot blot hybridization）n n凝胶电泳印迹转移杂交（SouthernSouthern blot blot hybridization)hybridization)n n原位杂交（inin-situ hybridizationsitu hybridization
4、）斑点杂交斑点杂交Dot Bolt Hybridization for HBV DNA Quantitationin 5 l of Patient Sera 凝胶电泳印迹转移杂交 原位杂交(Southernblot hybridization)(in-situhybridization Southernblot hybridization)(in-situhybridization）核酸分子杂交技术的应用核酸分子杂交技术的应用n n核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性 等n n在医学上，
5、目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域中。基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500m）排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。上图显示大量的DNA探针，按照一定的规律有序地排列在支撑物上，每个探针与相对应的特异互补序列结合后，即可发出荧光。利用该芯片可同时获取大量信息。DNA Microarray基因芯片技术原理n n大规模集成的固相杂交大规模集成的固相杂交 n n基本原理是核酸分子杂交
6、，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理 以以大大量量已已知知序序列列的的寡寡核核苷苷酸酸、cDNAcDNA或或基基因因片片段段作作探探针针，检检测测样样品品中中哪哪些些核核酸酸序序列列与与其其互互补补，然然后后通通过过定定性性、定定量量分分析析得得出出待待测样品的基因序列及表达的信息测样品的基因序列及表达的信息基因芯片的作用原理基因芯片的作用原理基因芯片的基因芯片的制作方式制作方式原位合成原位合成直接点样直接点样原位光蚀刻合成原位光蚀刻合成原位喷印合成原位喷印合成 分子印章法分子印章法针式点样针式点样喷墨点样喷墨点样光导原位合成法光导原位合成法基因芯片技术流程基因芯片技术流程基因芯片
7、的应用基因芯片的应用n n基因表达分析分析基因表达分析基因表达时时空特征空特征基因差异表达基因差异表达检测检测发现发现新基因新基因大大规规模模DNADNA测测序序n n基因型、基因突变和多态性分析n n疾病的诊断与治疗 遗传遗传病相关基因的定位病相关基因的定位肿肿瘤瘤诊诊断断感染性疾病的感染性疾病的诊诊断断耐耐药药菌株和菌株和药药敏敏检测检测聚合酶链反应(polymerase chain reaction reaction；PCR)l lPCR是八十年代中期问世的一种体外模拟体内DNA复制过程的技术，可在短时间内将待测特异性DNA扩增百万倍以上，并具有简单、快速、特异的特点，成为分子生物学发展
8、史的又一个里程碑。l lPCR不仅可检测各种DNA病毒的核酸，还可经过逆转录，检测各种RNA病毒的核酸，因而在各型肝炎病毒的检测中，敏感性远超过分子杂交，有着不可替代的作用。PCR 的常见类型的常见类型 n n常规常规PCRPCRn n逆转录逆转录PCRPCR（RTRTPCRPCR）n n巢式巢式PCRPCRnested-PCRnested-PCRn n原位原位PCRPCR（in-situ PCRin-situ PCR）n n多重多重PCRPCR u非对称非对称PCRu 免疫免疫PCRu 定量定量PCRu 随机引物随机引物PCRu 简并引物简并引物PCR u 锚定锚定PCR 实时荧光定量实时荧
9、光定量PCR荧光检测技术荧光检测技术n nSYBR Green I。是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。n n TaqMan 水解探针。由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的特异核苷酸序列组成。实时荧光定量实时荧光定量PCR：水解探针法：水解探针法退火延伸切割聚合完成l该法也称TaqMan技术，在PCR系统中，加入能和靶核酸模板杂交的探针，其5端带有荧光报告基团，发射的荧光被3端带有的荧光淬灭基团所吸收。l引物延伸时，由于聚合酶具有的53核酸外切酶作用，可把荧光报告基团从探针上切下，因与淬灭基团远离，发出的荧光不被淬灭，随模板扩增和游离荧光报告基团的增加而增强，并和初始靶核酸的量呈正相关。TaqMan法应用法应用n n起始模板的定量n n基因型分析n n目的基因定量n n产物鉴定n n单核苷酸多态性（SNP）分析Think You