《其他分子诊断检测技术PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《其他分子诊断检测技术PPT课件.ppt（77页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、关于其他分子诊断检测技术第一张，PPT共七十七页，创作于2022年6月第一节第一节 基因变异检测技术基因变异检测技术1.检测已知的基因突变2.检测未知的基因突变分子诊断检测基因突变的目的：分子诊断检测基因突变的目的：第二张，PPT共七十七页，创作于2022年6月几种常见的基因变异检测方法1PCR扩增阻碍突变系统扩增阻碍突变系统2寡核苷酸连接实验寡核苷酸连接实验3温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳4变性高效液相色谱法变性高效液相色谱法5错配接合蛋白质截短测试法错配接合蛋白质截短测试法第三张，PPT共七十七页，创作于2022年6月一、一、PCR扩增阻碍突变系统扩增
2、阻碍突变系统(PCR amplification regractory mytation system,PCR-ARMS)以以PCR方法为基础，检测已知点突变的一种方法。方法为基础，检测已知点突变的一种方法。又叫做又叫做PCR等位基因特异性扩增法等位基因特异性扩增法（PCR amplification of specific alleles,PASA）或或等位基因特异性等位基因特异性PCR(alleles-specific PCR,ASPCR)第四张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（一）基本原理 PCR的引物的引物3末端的核苷酸与模板之间存在末端的核苷酸与模板之间存在错配时，错配时，P
3、CR扩增效果差，或者不能扩增。扩增效果差，或者不能扩增。模板模板 3 5引物引物 5 3 A T G T T A T A C A A CPCR-ARMS第五张，PPT共七十七页，创作于2022年6月n设计设计2对引物，一对引物（对引物，一对引物（P1）与正常基因完全匹配，一）与正常基因完全匹配，一对引物对引物(P2)与突变基因完全匹配。与突变基因完全匹配。n用这两对引物分别扩增模板。用这两对引物分别扩增模板。n如果模板基因为正常基因，那么如果模板基因为正常基因，那么P1扩增可以得到大量产物，扩增可以得到大量产物，而而P2无产物。无产物。n如果模板已经突变，那么如果模板已经突变，那么P2扩增可以
4、获得大量产物，而扩增可以获得大量产物，而P1无产物。无产物。PCR-ARMS基本原理基本原理PCR-ARMS第六张，PPT共七十七页，创作于2022年6月5 33 5 ATGGTTCCTG TACCAAGGAC5 33 5 ATGGTACCTGTACCATGGAC突变突变等位基因等位基因正常正常等位基因等位基因顺利延长不能延长5 3ATCGTT5 3ATCGTT突变基因的引物P2的扩增PCR-ARMS第七张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（二）应用（二）应用1.检测单一点突变检测单一点突变2.基因分型基因分型3.检测多位点突变检测多位点突变PCR-ARMS的应用的应用第八张，PPT共七
5、十七页，创作于2022年6月1.检测单一点突变检测单一点突变n设计一对引物，可以扩增突变基因而对正常基因呈扩增设计一对引物，可以扩增突变基因而对正常基因呈扩增阻遏；阻遏；n附加一对引物，可以扩增标志性基因作为阳性对照；附加一对引物，可以扩增标志性基因作为阳性对照；nPCRPCR扩增完成，进行电泳，即可得知扩增完成，进行电泳，即可得知点突变点突变是否发生。是否发生。M MG NG 异常阳性对照阳性对照突变基因突变基因PCR-ARMS的应用的应用第九张，PPT共七十七页，创作于2022年6月2.基因分型基因分型n可用于单个突变的基因分型（鉴别杂合子和纯合子）或多可用于单个突变的基因分型（鉴别杂合子
6、和纯合子）或多态性分析态性分析PCR-ARMS的应用的应用1:正常基因的引物扩增结果；2：突变基因的引物扩增结果 M Wt1 Wt2 Ht1 Ht2 Hm1 Hm2 野生野生纯合子纯合子杂合子杂合子 突变突变纯合子纯合子方法一：方法一：正常等位基因野生纯合子点突变点突变突变杂合子稳定遗传稳定遗传突变纯合子第十张，PPT共七十七页，创作于2022年6月方法二：方法二：野生野生纯合子纯合子杂合子杂合子 突变突变纯合子纯合子 M Wt Ht Hm5335496 bp371 bp野生型基因引物野生型基因引物突变型基因引物突变型基因引物突变点突变点PCR-ARMS的应用的应用第十一张，PPT共七十七页，
7、创作于2022年6月3.3.检测多位点突变检测多位点突变突变点突变点1突变点突变点2片段1 片段2PCR-ARMS的应用的应用PCR-ARMSPCR-ARMS可同时检测多个点突变。可同时检测多个点突变。第十二张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（三）方法学评价（三）方法学评价n适用于较少点突变的检测；适用于较少点突变的检测；n具有低具有低-中等批量处理能力；中等批量处理能力；n可借助多重可借助多重PCR检测多个点突变；检测多个点突变；n无需放射性标记；无需放射性标记；n无需昂贵的试剂；无需昂贵的试剂；n无需复杂的检测系统无需复杂的检测系统PCR-ARMS优点优点缺点缺点只能检测只能检测已
8、知的已知的基因突变及多态性基因突变及多态性第十三张，PPT共七十七页，创作于2022年6月二、寡核苷酸连接实验二、寡核苷酸连接实验(oligonucleotide ligation assay,OLA)n利用利用DNA连接酶，将连接酶，将2段寡核苷酸探针顺向连接，段寡核苷酸探针顺向连接，从而检测靶基因型的一种方法。从而检测靶基因型的一种方法。n该方法因为可靠、精确、重现性好，已成为临床遗传病分子该方法因为可靠、精确、重现性好，已成为临床遗传病分子诊断的一种基本方法。诊断的一种基本方法。第十四张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（一）基本原理（一）基本原理n嗜温性或耐热的连接酶具有高特异性
9、和高保真性，它能连接与模嗜温性或耐热的连接酶具有高特异性和高保真性，它能连接与模板序列完全互补的两段核苷酸片段。板序列完全互补的两段核苷酸片段。OLA的基本原理的基本原理DNA 连接酶连接酶5 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT G C TAAGGACTAG3 55 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT A C TAAGGACTAG3 5第十五张，PPT共七十七页，创作于2022年6月双等位基因变异的检测双等位基因变异的检测OLA的基本原理的基本原理探针1 5 等位基因A 3 TACCAAGGA C G AT TCC
10、TGATC ATGGTTCCT G C TAAGGACTAG3 5 TACCAAGGA G G AT TCCTGATC ATGGTTCCT C C TAAGGACTAG3 5探针2 5 等位基因a 3通用探针通用探针第十六张，PPT共七十七页，创作于2022年6月OLA实验的操作实验的操作n耐热连接酶，可使变性和连接连续进行，产物呈线耐热连接酶，可使变性和连接连续进行，产物呈线性增长，大大增加了检测的灵敏度；性增长，大大增加了检测的灵敏度；n若若PCR扩增引物的扩增引物的Tm值大于探针的值大于探针的Tm值，可在同一值，可在同一管内先进行管内先进行PCR，再进行，再进行OLA实验，大大减少了污染
11、，实验，大大减少了污染，提高检测效率。提高检测效率。2.条件：条件：1.反应体系：反应体系：3.方法的发展：方法的发展：n2个探针、个探针、DNA连接酶、模板连接酶、模板n探针与靶序列的杂交区域足够长（探针与靶序列的杂交区域足够长（20bp）n温度：能使探针和靶序列杂交温度：能使探针和靶序列杂交OLA的基本原理的基本原理第十七张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（二）临床应用（二）临床应用1.镰状细胞贫血症镰状细胞贫血症的分子诊断、产前检查的分子诊断、产前检查2.多种遗传病及常见病的检测多种遗传病及常见病的检测(P168)；3.局部地区人群的遗传病分子检测局部地区人群的遗传病分子检测PC
12、R-OLA的应用的应用第十八张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（三）方法学评价（三）方法学评价n能可靠地鉴别基因型及纯、杂合子；能可靠地鉴别基因型及纯、杂合子；n不容易产生假阴性和假阳性结果；不容易产生假阴性和假阳性结果；n利用耐热连接酶循环进行连接，使信号放大，更增强了该利用耐热连接酶循环进行连接，使信号放大，更增强了该法的灵敏度法的灵敏度优点：优点：缺点：缺点：n 需要多相参与，增加实验的复杂度；需要多相参与，增加实验的复杂度；n 需要需要PCR扩增与扩增与OLA相结合，相结合，PCR的非特异性扩增导致的非特异性扩增导致了该方法的重现性不够了该方法的重现性不够PCR-OLA的方法学
13、评价的方法学评价第十九张，PPT共七十七页，创作于2022年6月三、温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电三、温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳泳 利用不同的分子在利用不同的分子在不同浓度的变性剂不同浓度的变性剂作用下，失作用下，失活而活而改变分子构象改变分子构象，进而进行分离的一种电泳技术。，进而进行分离的一种电泳技术。利用不同的分子在利用不同的分子在不同的温度不同的温度下，下，构象改变构象改变的不同的不同而进行分离的一种电泳技术。而进行分离的一种电泳技术。u 温度梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳 （Temperature gradient gel electrophoresis,TGGE）u 变性梯
14、度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 (denaturing-gradient gel electrophoresis,DGGE)46 50 54 58 62第二十张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（一）TGGE的基本原理 普通的非变性凝胶电泳不能分离具有相似长度的普通的非变性凝胶电泳不能分离具有相似长度的DNA，所以也不能分离发生了单核苷酸突变的，所以也不能分离发生了单核苷酸突变的DNA序列。序列。但是在温度梯度凝胶电泳中，随着温度的逐渐升高，但是在温度梯度凝胶电泳中，随着温度的逐渐升高，DNA分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链DNA分子表现出
15、一种复杂的分枝构象，使得其电泳迁移分子表现出一种复杂的分枝构象，使得其电泳迁移率大大下降。率大大下降。TGGE第二十一张，PPT共七十七页，创作于2022年6月TGGE的的基本原理基本原理TGGE5 33 5 ATGGTTCCTG TACCAAGGAC3 5 ATGGCTCCTG TACCGAGGAC5 3正常正常等位基因等位基因突变突变等位基因等位基因Tm=54Tm=5846 50 54 58 62 正常基因突变基因第二十二张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（二）突变的检测原理（二）突变的检测原理正常等位基因点突变点突变突变杂合子稳定遗传稳定遗传突变纯合子PCR扩增wt/wt wt/
16、wt,mt/mt,wt/mt,mt/wt mt/mtPCR产物产物基因型基因型TGGE第二十三张，PPT共七十七页，创作于2022年6月1 2 3 45 6 1 2 3 4 5 6a 异源b 双链带c 同源d 双链带1，5，6为点突变的杂合子；2为突变的纯合子；3，4为野生的纯合子.TGGE第二十四张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（三）变性梯度凝胶电泳（三）变性梯度凝胶电泳（DGGE）实验）实验 实验原理与实验原理与TGGE一致，只不过在一致，只不过在DGGE中，中，变性条件变性条件取代了取代了TGGE的温度。的温度。在在DGGE试验中，有试验中，有2个变性条件：个变性条件：u 热：
17、一般采用热：一般采用60的恒定温度；的恒定温度；u 变性剂：固定比率的甲酰胺、尿素变性剂：固定比率的甲酰胺、尿素TGGE/DGGE 如果想要获得很好的实验结果，还有耐于利用相关如果想要获得很好的实验结果，还有耐于利用相关软件优化实验条件：电泳时间、凝胶的浓度、变性的梯软件优化实验条件：电泳时间、凝胶的浓度、变性的梯度等。度等。第二十五张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（四）临床应用（四）临床应用1.广泛应用于疾病基因的突变检测，尤其是一个等位基因发生广泛应用于疾病基因的突变检测，尤其是一个等位基因发生突变就会引起的疾病检测；突变就会引起的疾病检测；2.筛选人类基因的多态性；筛选人类基因
18、的多态性；3.人类基因的突变检测，如人类基因的突变检测，如P53、FBN1等基因；等基因；4.线粒体线粒体DNA中的基因突变及多态性检测；中的基因突变及多态性检测；5.粪便及肠内微生物多态性的鉴定；粪便及肠内微生物多态性的鉴定；6.病毒基因组的突变鉴定及不同病毒株之间的基因组差病毒基因组的突变鉴定及不同病毒株之间的基因组差异鉴定。异鉴定。TGGE/DGGE第二十六张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（五）方法学评价（五）方法学评价n高分辨率，能高分辨率，能100%检出对单个碱基突变的基因；检出对单个碱基突变的基因；n结合结合GC夹、补骨脂素夹或双边夹，可提高其灵敏度，获得更高夹、补骨脂素
19、夹或双边夹，可提高其灵敏度，获得更高的检出率。的检出率。TGGE/DGGE优点优点缺点缺点合成带合成带GC夹的引物需要特定的仪器，成本较高。夹的引物需要特定的仪器，成本较高。第二十七张，PPT共七十七页，创作于2022年6月n色谱法色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，其也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，其原理是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附原理是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。将它用于分析化学能力等亲和能力的不同来进行分离的。将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。并配合适当的检测手段，就成为色谱分
20、析法。n高效液相色谱高效液相色谱：以液体为流动性，高速、高效率地分离混合物的一：以液体为流动性，高速、高效率地分离混合物的一种色谱技术。种色谱技术。n变性高效液相色谱：变性高效液相色谱：改进传统高效液相色谱的分离系统，并改进传统高效液相色谱的分离系统，并运用变温分析方式，高效分离各种生物大分子（包括运用变温分析方式，高效分离各种生物大分子（包括DNA）的一种方法。的一种方法。四、变性高效液相色谱法四、变性高效液相色谱法（denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)DHPLC第二十八张，PPT共七十七页，创作于2022年6月排阻
21、色谱排阻色谱 亲和色谱亲和色谱第二十九张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（一）DHPLC的基本原理1.DHPLC的分离系统的分离系统2.DHPLC分离分离DNA的原理的原理3.DHPLC检测突变的原理检测突变的原理DHPLC第三十张，PPT共七十七页，创作于2022年6月1.DHPLC的分离系统的分离系统DHPLC1.色谱柱的色谱柱的填料填料 特性特性：电中性，疏水性：电中性，疏水性固定相固定相:C18基基 质：质：聚苯乙烯聚苯乙烯-二乙烯基苯（二乙烯基苯（PS-DVB)2.离子对试剂离子对试剂：三乙基铵醋酸盐（：三乙基铵醋酸盐（TEAA）特性特性：带正电荷，疏水性：带正电荷，疏水性3
22、.流动相流动相：乙腈：乙腈 特性特性：通过改变浓度，将：通过改变浓度，将DNA分子按结合程度的不同，逐步分子按结合程度的不同，逐步洗脱下来。洗脱下来。第三十一张，PPT共七十七页，创作于2022年6月PO3-TEAAC182.DHPLC分离分离DNA的原理的原理DHPLC第三十二张，PPT共七十七页，创作于2022年6月DHPLC3.DHPLC检测突变的原理检测突变的原理变性后，缓慢退火变性后，缓慢退火分离手段分离手段：非变性分离非变性分离部分变性分离部分变性分离完全变性分离完全变性分离第三十三张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（二）临床应用（二）临床应用1.乳腺癌相关基因乳腺癌相关基
23、因BRCA1、BRCA2及及ATM等疾病相等疾病相关基因的分子检测；关基因的分子检测；2.短的串联重复序列的基因分型；短的串联重复序列的基因分型；3.肿瘤样本中杂合性缺失的检测；肿瘤样本中杂合性缺失的检测；4.Y染色体和常染色体染色体和常染色体DNA序列的筛查序列的筛查5.酵母、拟南芥、果蝇及小鼠的基因组作图及基因克隆。酵母、拟南芥、果蝇及小鼠的基因组作图及基因克隆。DHPLC第三十四张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（三）方法学评价（三）方法学评价优点：优点：具有更高的具有更高的准确性准确性和和敏感度。敏感度。DHPLC检测特性检测特性SSCPTGGE/DGGEDHPLCDNA测序测
24、序检出范围0.5%的变异20%的变异检出率50%-95%40%-100%100%80%工作度需要特殊的GC夹辅助，增加了工作量快速，2-3 min费时费力第三十五张，PPT共七十七页，创作于2022年6月错配接合蛋白质截短测试法（错配接合蛋白质截短测试法（PTT）：）：又称为体外蛋白质合成检测技术又称为体外蛋白质合成检测技术(IVPS),只检测与只检测与疾病相关的突变，即检测使蛋白不能全长翻译的突变。疾病相关的突变，即检测使蛋白不能全长翻译的突变。五、错配接合蛋白质截短测试法五、错配接合蛋白质截短测试法（protein truncation test,PTT)第三十六张，PPT共七十七页，创作
25、于2022年6月（一）PTT的原理PTT检测基因缺失、检测基因缺失、异常的复制或剪接异常的复制或剪接检测翻译终止突变检测翻译终止突变第三十七张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（二）临床应用（二）临床应用1.最早被用于杜氏肌营养不良的检测；最早被用于杜氏肌营养不良的检测；2.家族性腺瘤样息肉病；家族性腺瘤样息肉病；3.遗传性硬纤维瘤病；遗传性硬纤维瘤病；4.共济失调共济失调毛细血管扩张症；毛细血管扩张症；5.遗传性乳腺癌；遗传性乳腺癌；6.卵巢癌等。卵巢癌等。PTT第三十八张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（三）方法学评价（三）方法学评价优点：优点：PTT1.不仅可检测出只与疾病
26、相关的蛋白截短突变，还能检测不仅可检测出只与疾病相关的蛋白截短突变，还能检测出在出在RNA形成过程中发生的突变。形成过程中发生的突变。2.可以直接采用可以直接采用mRNA进行检测，减少了操作步骤，加快进行检测，减少了操作步骤，加快了分析进程；了分析进程；3.只鉴定引起疾病的截短突变，不会受到基因沉默的影响；只鉴定引起疾病的截短突变，不会受到基因沉默的影响；4.截短蛋白质分子的长度指明了突变的位置，可以更方便地进截短蛋白质分子的长度指明了突变的位置，可以更方便地进行行DNA测序分析以确定突变。测序分析以确定突变。第三十九张，PPT共七十七页，创作于2022年6月DHPLC缺点：缺点：1.最佳检测
27、范围为最佳检测范围为2kb的基因组或的基因组或1.3-1.6kb的的cDNA，因此，因此对于序列较长、包含多个外显子的疾病基因，需要分几次进对于序列较长、包含多个外显子的疾病基因，需要分几次进行检测；行检测；2.PTT因为凝胶的分辨率，而检测不出编码序列中小的插入或因为凝胶的分辨率，而检测不出编码序列中小的插入或错义突变；错义突变；3.引起引起RNA产量改变或使产量改变或使mRNA不稳定的突变可能被漏检。不稳定的突变可能被漏检。第四十张，PPT共七十七页，创作于2022年6月谢 谢！第四十一张，PPT共七十七页，创作于2022年6月第二节第二节 脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳 交替采用两个方
28、向的不均匀电场，使DNA分子在连续间隔交替的电场中，不断改变方向运动，从而将DNA按分子大小分开的电泳技术。脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)特点特点：能分离：能分离50 kb-10 Mb50 kb-10 Mb的的DNADNA片段。片段。第四十二张，PPT共七十七页，创作于2022年6月n 在在PFGE中，电场的方向、脉冲时间和电压大小可交替改变。中，电场的方向、脉冲时间和电压大小可交替改变。n 在每次电场方向改变时，在每次电场方向改变时，DNA分子都需要时间来改变其分子构型和迁移方向。分子都需要时间来改变其分子构型和
29、迁移方向。n DNA分子越大，分子构型转换所需的时间越长，转变迁移方向的时间也越长。分子越大，分子构型转换所需的时间越长，转变迁移方向的时间也越长。n 不同大小的不同大小的DNA分子，因为其改变泳动方向的时间不同，迁移速度也就不同，从而可以在脉冲分子，因为其改变泳动方向的时间不同，迁移速度也就不同，从而可以在脉冲电场中很好地分开。电场中很好地分开。一、一、PFGE的原理的原理第四十三张，PPT共七十七页，创作于2022年6月二、二、PFGE的一般步骤的一般步骤真核或原核细胞真核或原核细胞1.包埋包埋2.原位裂解原位裂解3.限制性酶切限制性酶切4.脉冲电泳脉冲电泳5.结果分析结果分析原位裂解获得
30、原位裂解获得完整的染色体完整的染色体DNA与琼脂糖混合制备与琼脂糖混合制备包埋块（含有染色体）包埋块（含有染色体）限制性酶切后电泳限制性酶切后电泳第四十四张，PPT共七十七页，创作于2022年6月三、三、PFGE的种类的种类1.倒转电场凝胶电泳（倒转电场凝胶电泳（field-inversion gel electrophoresis,FIGE）2.交流电场凝胶电泳（交流电场凝胶电泳（transverse-alternating field gel electrophoresis,TAFE）3.钳位均匀电场凝胶电泳（钳位均匀电场凝胶电泳（contour-clamped homogeneous e
31、lectric fields,CHEF）4.旋转凝胶电泳（旋转凝胶电泳（rotating gel electrophoresis,RGE）第四十五张，PPT共七十七页，创作于2022年6月u两个电场方向为两个电场方向为180u脉冲间隔时间为：脉冲间隔时间为：向前向前向后向后=31u装置简单：电泳槽和脉冲电极控制器装置简单：电泳槽和脉冲电极控制器u分离片段范围：分离片段范围：10 kb-800 kb特点：特点：1.1.倒转电场凝胶电泳倒转电场凝胶电泳（FIGE）第四十六张，PPT共七十七页，创作于2022年6月u两个电场方向为两个电场方向为115 165 u样品在凝胶中呈样品在凝胶中呈“之之”字
32、形泳动字形泳动u分离片段可大至分离片段可大至 1 600 kbu在病原生物的基因分析中有特殊的用途在病原生物的基因分析中有特殊的用途特点：特点：2.2.交流电场凝胶电泳（交流电场凝胶电泳（TAFETAFE）第四十七张，PPT共七十七页，创作于2022年6月u目前应用最广泛的一类脉冲电泳目前应用最广泛的一类脉冲电泳u没有所谓的没有所谓的“负极负极”,两个主要的电场方向呈两个主要的电场方向呈120uDNA分子在凝胶中能很好地聚焦分子在凝胶中能很好地聚焦 u分离片段可大至分离片段可大至7 000 kb特点：特点：3.钳位均匀电场凝胶电泳（钳位均匀电场凝胶电泳（CHEF）第四十八张，PPT共七十七页，
33、创作于2022年6月u只有一个均一的电场只有一个均一的电场u凝胶可以周期性旋转凝胶可以周期性旋转u用于不同电场角度时，脉冲时间、电压等参数对用于不同电场角度时，脉冲时间、电压等参数对DNA分离效果的影响分离效果的影响u分离片段范围：分离片段范围：50 kb-6 000 kb特点：特点：4.旋转凝胶电泳（旋转凝胶电泳（RGE）第四十九张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（二）（二）PFGE的应用的应用1.菌株的基因分型；菌株的基因分型；2.制备某个菌株的染色体图谱；制备某个菌株的染色体图谱；3.大质粒的分离和大小测定。大质粒的分离和大小测定。PFGE第五十张，PPT共七十七页，创作于202
34、2年6月1.1.菌株的基因分型；菌株的基因分型；传统的细菌分型方法：传统的细菌分型方法：生物学分型；生物学分型；血清学分型；血清学分型；噬菌体分型；噬菌体分型；细菌素分型；细菌素分型；优点：优点：分辨率高；分辨率高；准确度高；准确度高；对流行病学的研究贡献大对流行病学的研究贡献大PFGE第五十一张，PPT共七十七页，创作于2022年6月2.2.制备某个菌株的染色体图谱制备某个菌株的染色体图谱作用：作用：鉴定基因大小；鉴定基因大小；构建菌株的基因组物理图谱构建菌株的基因组物理图谱 A BPFGE第五十二张，PPT共七十七页，创作于2022年6月3.3.大质粒的分离和大小测定大质粒的分离和大小测定
35、操作方法：操作方法：将细菌包埋在琼脂糖块中；将细菌包埋在琼脂糖块中；裂解细胞壁；裂解细胞壁；S1核酸酶酶切；核酸酶酶切；PFGE电泳电泳PFGE第五十三张，PPT共七十七页，创作于2022年6月第三节第三节 分子影像分子影像 1999年由年由Weissleder等人提出，也被称为等人提出，也被称为分子成分子成像像或或分子显像分子显像，它是指，它是指在活体状态下在活体状态下从细胞、基因和分子从细胞、基因和分子水平，通过水平，通过无创伤的影像技术无创伤的影像技术，对，对其生物学行为其生物学行为进行进行定性定性和和定量定量研究。研究。分子影像分子影像(molecular imaging)第五十四张，
36、PPT共七十七页，创作于2022年6月n 分子探针分子探针是分子影像中的关键组成部分，高特异性的分是分子影像中的关键组成部分，高特异性的分子探针是进行分子影像学研究的先决条件。子探针是进行分子影像学研究的先决条件。一、分子影像探针分子探针分子探针示踪剂示踪剂:放射性核素、顺磁性物质或荧光素等放射性核素、顺磁性物质或荧光素等能参与体内自然的生理生化活动的特殊分子能参与体内自然的生理生化活动的特殊分子:受体、生物酶及单克隆抗体受体、生物酶及单克隆抗体n 分子影像探针：一类带有分子影像探针：一类带有示踪剂示踪剂，能，能参与体内自然的生理生化参与体内自然的生理生化活动活动的特殊分子。的特殊分子。第五十
37、五张，PPT共七十七页，创作于2022年6月n 分子探针需要具备的特点：分子探针需要具备的特点：1.相对分子质量小、纯度高、安全，不影响所研究的相对分子质量小、纯度高、安全，不影响所研究的疾病过程；疾病过程；2.具有良好的生物学功能，能参与人体正常的生理具有良好的生物学功能，能参与人体正常的生理生化活动；生化活动；3.能够克服人体内部的能够克服人体内部的“生理屏障生理屏障”（如脑屏障、血（如脑屏障、血管壁、细胞膜等），顺利到达靶分子所在的器官，管壁、细胞膜等），顺利到达靶分子所在的器官，同时不会积聚于其他组织；同时不会积聚于其他组织；4.示踪剂、分子探针和靶分子应该紧密结合，不能脱示踪剂、分子
38、探针和靶分子应该紧密结合，不能脱落，且有足够长的半衰期以便于检测。落，且有足够长的半衰期以便于检测。第五十六张，PPT共七十七页，创作于2022年6月n 根据分子探针的不同，分子影像有根据分子探针的不同，分子影像有2种基本的种基本的检测策略：检测策略：1.直接成像直接成像2.间接成像：间接成像：采用一个采用一个特异性探针特异性探针(细胞表面报告分子、细胞内分细胞表面报告分子、细胞内分子或基因表达产物），子或基因表达产物），它它与靶分子作用与靶分子作用可直接提供一个与可直接提供一个与靶分子浓度相关的信号而成像。靶分子浓度相关的信号而成像。一般需要一个一般需要一个报告基因报告基因和一个和一个报告探
39、针报告探针，它们，它们在特定在特定的靶细胞的靶细胞中中相互作用相互作用产生一个代谢物截留于细胞中发出信产生一个代谢物截留于细胞中发出信号，通过成像设备探测到而成像。号，通过成像设备探测到而成像。第五十七张，PPT共七十七页，创作于2022年6月二、分子影像学技术二、分子影像学技术（一）（一）放射性核素成像（放射性核素成像（radionuclide imaging）（二）（二）磁共振成像（磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）（三）（三）光学成像（光学成像（optical imaging）第五十八张，PPT共七十七页，创作于2022年6月n 正电子发射计算机断
40、层成像技术正电子发射计算机断层成像技术（positron emission tomography,PET）n 单光子发射计算机断层扫描技术单光子发射计算机断层扫描技术（single photon emission computed tomography,SPECT）2.常用的放射性核素成像技术：常用的放射性核素成像技术：（一）（一）放射性核素成像放射性核素成像1.概念概念 将有将有明确生物学效应明确生物学效应的的放射性探针放射性探针导入人体内，导入人体内，使它参与体内的生物学活动，利用相关成像技术进行使它参与体内的生物学活动，利用相关成像技术进行探测和显像，以反映体内特定的生物学活动过程，从探
41、测和显像，以反映体内特定的生物学活动过程，从而了解体内的生理、生化状态。而了解体内的生理、生化状态。第五十九张，PPT共七十七页，创作于2022年6月 又被称为生化显像或又被称为生化显像或功能分子显像技术功能分子显像技术，集中了核物，集中了核物理、放射化学、分子生物学和医学影像新技术的优势，理、放射化学、分子生物学和医学影像新技术的优势，从分子水平上观察细胞代谢的活动，可提供独特的生理从分子水平上观察细胞代谢的活动，可提供独特的生理性示踪研究和活体生化显像。性示踪研究和活体生化显像。特点：特点：n 正电子发射计算机断层成像技术正电子发射计算机断层成像技术（positron emission t
42、omography,PET）第六十张，PPT共七十七页，创作于2022年6月检测策略检测策略 将人体代谢所需要的物质（如葡萄糖、蛋白质等）将人体代谢所需要的物质（如葡萄糖、蛋白质等）标记上短寿命的放射性核素（如标记上短寿命的放射性核素（如14C、13N）制成探针注入）制成探针注入人体内。因为病变组织和正常组织的代谢状态不同，它们富人体内。因为病变组织和正常组织的代谢状态不同，它们富集的示踪剂的量不同。示踪剂中的放射性核素的正电子与人集的示踪剂的量不同。示踪剂中的放射性核素的正电子与人体内的一个负电子湮灭能产生体内的一个负电子湮灭能产生两个两个互呈互呈180发射的发射的光子，而光子，而被被PET
43、设备捕获。设备捕获。通过对放射性核素的检测成像，通过对放射性核素的检测成像，PET可显示出示踪剂的分布可显示出示踪剂的分布情况和聚集的部位、组织或器官以及量的多少，从而对疾病进行情况和聚集的部位、组织或器官以及量的多少，从而对疾病进行定位、定量、定性及定期分析定位、定量、定性及定期分析。（1）直接成像：）直接成像：第六十一张，PPT共七十七页，创作于2022年6月u 常用的报告基因：常用的报告基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶（单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）等）等（2）间接成像：）间接成像：u 原理：原理：胸苷类似物经放射性核素标记后称为探针，可以通过主胸苷类似物经放射性核素标记后称为探针，可以
44、通过主动转运自由通过细胞膜。但该物质可被细胞内表达出的动转运自由通过细胞膜。但该物质可被细胞内表达出的HSV-TK酶磷酸化，而不能再自由穿过细胞膜而滞留于细胞内，其酶磷酸化，而不能再自由穿过细胞膜而滞留于细胞内，其放射性的信号指示放射性的信号指示HSV-TK的存在，证明外源基因的转染和的存在，证明外源基因的转染和表达。表达。第六十二张，PPT共七十七页，创作于2022年6月某个特定的某个特定的器官或组织器官或组织细胞细胞表达表达HSV-TKHSV-TK与胸与胸苷类似物特异苷类似物特异性结合，并发性结合，并发生磷酸化生磷酸化成像成像发出信号发出信号HSV-TK基因基因携带报告基携带报告基因的细胞
45、因的细胞带标记的探针带标记的探针检测信号检测信号n 间接成像示意图间接成像示意图第六十三张，PPT共七十七页，创作于2022年6月2.SPECT技术技术原理：原理：通过探测和处理体内的放射性核素自行发射的通过探测和处理体内的放射性核素自行发射的单个单个的的光子构成断层图像，它可以反映器官结构及功能状态，现光子构成断层图像，它可以反映器官结构及功能状态，现已用于临床检测。已用于临床检测。与与PET技术的方法学比较：技术的方法学比较：PET技术：技术：一次检查，全身显像；一次检查，全身显像；但设备昂贵，且核素半衰期短，但设备昂贵，且核素半衰期短，不能同时检测多个探针不能同时检测多个探针SPECT技
46、术：价格便宜，可同时进行多探针成像；技术：价格便宜，可同时进行多探针成像；但只能进行半定量分析。但只能进行半定量分析。第六十四张，PPT共七十七页，创作于2022年6月（二）（二）磁共振成像磁共振成像n 基本原理基本原理 在外加磁场的作用下，在外加磁场的作用下，氢原子核氢原子核（H）即质子以一种特定方式）即质子以一种特定方式绕磁场方向旋转。用一个适当频率的绕磁场方向旋转。用一个适当频率的射频脉冲射频脉冲从与主磁场相垂直从与主磁场相垂直的方向上的方向上对质子进行激发对质子进行激发后，会引起后，会引起质子共振质子共振，成为激发态，即所，成为激发态，即所谓磁共振。在射频脉冲停止后，质子在由激发态转变
47、为原始态时，谓磁共振。在射频脉冲停止后，质子在由激发态转变为原始态时，会发射出与激发脉冲频率相同的信号。通过身体附近的接受器接收，会发射出与激发脉冲频率相同的信号。通过身体附近的接受器接收，并经计算机处理，就可获得并经计算机处理，就可获得MRI图像。图像。人体人体2/3的重量为水分，如此高的比例正是磁共振成像技术能的重量为水分，如此高的比例正是磁共振成像技术能被广泛应用于医学诊断的基础。人体内器官和组织中的水分并不被广泛应用于医学诊断的基础。人体内器官和组织中的水分并不相同，很多疾病的病理过程会导致水分形态的变化，即可由磁共相同，很多疾病的病理过程会导致水分形态的变化，即可由磁共振图像反应出来
48、。振图像反应出来。第六十五张，PPT共七十七页，创作于2022年6月MRI显示左显示左肾囊肿肾囊肿第六十六张，PPT共七十七页，创作于2022年6月n 磁共振成像的策略磁共振成像的策略间接成像间接成像 为了增强磁共振在病变组织的信号，通常采用标为了增强磁共振在病变组织的信号，通常采用标记报告基因，并将其转染靶细胞并在靶细胞内大量扩记报告基因，并将其转染靶细胞并在靶细胞内大量扩增来放大增来放大MR信号成像。信号成像。常用的报告基因：常用的报告基因：1.酪氨酸激酶酪氨酸激酶2.-半乳糖苷酶半乳糖苷酶3.转铁蛋白受体转铁蛋白受体第六十七张，PPT共七十七页，创作于2022年6月1.酪氨酸激酶酪氨酸激
49、酶u 胞内受体；胞内受体；u 它是黑色素合成的限速酶，而黑色素有高度结合铁的能力；它是黑色素合成的限速酶，而黑色素有高度结合铁的能力；u 酪氨酸激酶的过量表达会导致黑色素合成增加，从而使其结酪氨酸激酶的过量表达会导致黑色素合成增加，从而使其结合铁的量也相应增加，而增强合铁的量也相应增加，而增强MR信号。信号。第六十八张，PPT共七十七页，创作于2022年6月2.-半乳糖苷酶半乳糖苷酶u 胞内受体；胞内受体；u 该系统采用的分子探针：由钆（该系统采用的分子探针：由钆（ga）的不配对电子组）的不配对电子组成，探针周围由一个化学箍环封闭，不能与水分子反应，成，探针周围由一个化学箍环封闭，不能与水分子
50、反应，箍环上有一个糖分子作箍环上有一个糖分子作“门门”。u 当当-半乳糖苷酶存在时，糖分子被降解，半乳糖苷酶存在时，糖分子被降解，“门门”开放，开放，钆就暴露在水分子中，其不配对电子与氢质子作用，增强钆就暴露在水分子中，其不配对电子与氢质子作用，增强了了MR信号。信号。第六十九张，PPT共七十七页，创作于2022年6月3.转铁蛋白受体转铁蛋白受体u 细胞表面蛋白受体；细胞表面蛋白受体；u 分子探针：超顺磁性的单晶氧化铁微粒和转铁蛋白分子探针：超顺磁性的单晶氧化铁微粒和转铁蛋白的复合物；的复合物；u 转铁蛋白受体通过与转铁蛋白转铁蛋白受体通过与转铁蛋白-铁结合形成复合体，铁结合形成复合体，将铁转