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1、精选优质文档-倾情为你奉上大蒜SOD的提取与分离1、 实验目的: 1、熟悉大蒜SOD的提取与分离方法 2、掌握SOD活力测定NBT光化还原法的原理3 熟悉G-250法对蛋白浓度的测定以及PAGE电泳的操作方法2、 实验的原理1、通过研磨和高速离心的方法粗提大蒜SOD,再经过丙酮沉淀得到SOD酶液2、由于SOD是含金属辅基的酶,通过氮蓝四(NBT)光还原法测定酶的活性。NBT在蛋氨酸和核黄素存在的条件下,照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙,在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制NBT的光化还原,其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。3考马斯亮蓝G250与蛋白质通过疏水结合作用后,变为蓝色,在
2、波长为595nm处测得吸光度,用EXCEL软件得出标准曲线,从而得到待测的蛋白浓度。3、 实验的材料和试剂(1)新鲜蒜瓣;(2)磷酸buffer(0.05mol/L,pH7.8);(3)氯仿:无水乙醇(3:5,V/V);(4)丙酮,冷却至410四、实验步骤1、SOD的提取称取150g大蒜蒜瓣 2倍体积的0.05mol/L磷酸buffer pH7.8研磨继续研磨至浆状弃沉淀,取上清液(留34ml样用作分析)4800rpm,离心15min静置20min(使SOD充分溶解到buffer中)0.25倍体积的氯仿:乙醇混合溶剂2、 除杂蛋白搅拌15min上清液 离心(4800rpm,15min)去杂蛋白
3、,得粗酶溶液(留2ml样用作分析)粗酶液3、SOD的沉淀分离5560热处理15min,流水冷却溶于0.05mol/LpH7.8磷酸buffer(留2ml样用作分析) SOD沉淀离心,4800rpm,15min等体积冷丙酮 离心(4800rpm,15min) 弃沉淀,得到SOD酶液(留2ml样用作分析)5、 结果分析1、SOD活力测定NBT光化还原法试剂:(1)0.026mol/L蛋氨酸(Met)溶液;(2)7510-5mol/L氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液;(3)1.0mol/LEDTA及210-5mol/L核黄素溶液。表1 反应各系统中试剂用量(ml) 试剂杯号0.026mol/LMet缓
4、冲液7510-5mol/LNBT1.0mol/LEDTA210-5mol/L核黄素酶液0.05mol/L磷酸缓冲液pH=7.811.50.30.300.921.50.30.300.931.50.30.300.941.50.30.310ul0.951.50.30.320ul0.961.50.30.350ul0.971.50.30.3100ul0.981.50.30.300.9试液全部加入后,充分混匀,除1号杯置于暗处外,其余均在25,光强为3000Lux的2盏20W日光灯下照光15分钟,然后立即遮光停止反应,于560nm以第一号杯调零,测定光密度。以2、3号杯液光密度的平均值作为还原率100%,
5、分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率,作出二者相关曲线(以酶液用量为横坐标,以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标),找出50%抑制的酶液量(l)作为一个酶活单位。结果计算:SOD活力按下式计算: V100060A= BWT式中 A:酶活力(酶活力单位g 1FWh1);V:酶提取液体积(ml);B:一个酶活单位的酶液量(l);W:样品鲜重(g);T:反应时间(min)。图1 以酶液用量为横坐标,以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标2、蛋白质浓度的测定-考马斯亮蓝G-250法考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕褐色,它与蛋白质通过疏水结合作用后,变为蓝色,最大吸收光谱从470
6、nm移至595nm,在一定条件下,蛋白质的浓度与595nm吸光度呈正比例。该法灵敏度在0.011.0g/ml。快速简便,但在不同蛋白质之间差异甚大,且标准曲线在高浓度时线性关系较差。1.试剂(1)标准蛋白液: 0.1mg/ml BSA贮液,以0.9%生理盐水配制。(2)蛋白质分析反应剂(Protein assay reagent): 取0.1g之考马斯亮蓝 G-250溶于50 ml 95% 酒精中,完全溶解后加入100 ml之85%(w/v) 磷酸,最后将总体积以二次水补至1000ml。2.标准曲线制作蛋白质定量测定标准曲线制作溶液0管1管2管3管4管5管留样1留样1系列标准蛋白液/ml0.2
7、0.40.60.81.011实际蛋白质含量/g204060801000.9%生理盐水/ml1.00.80.60.40.2-蛋白质染色液/ml5.05.05.05.05.05.05.05.0轻轻摇匀,5min后以0管调空白,595nm分光光度法测光密度值,绘出标准曲线。未知样品从标准曲线上查出相应浓度。图2根据得到的蛋白质曲线得到公式: y=0.0096x-0.0144 。3、SOD纯度的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)1.试剂1.1凝胶贮备液和缓冲液配制见表。凝胶贮备液和缓冲液配制表贮备液名称100ml中含量pH配制溶液时比例A1mo/LHCl 48ml8.9分离胶A:C:水:G=1:2:1
8、:4凝胶浓度7.5% pH8.9 Tris 36gTEMED 0.24mlCAcr 30gBis 0.8gG过硫酸胺 0.14gB1mol/LHCl 48ml6.7浓缩胶B:D:E:F=1:2:1:4凝胶浓度 2.5% pH6.7Tris 5.9gTEMED 0.46mlDAcr 10gBis 2.5gE核黄素 4mgF蔗糖 40g电极缓冲液Tris 6g 甘氨酸 28.8 水定容至 1000ml8.3使用时稀释10倍1.2 0.1%溴酚蓝指示剂。1.3染色液(0.05%考马斯亮蓝R250的20%磺基水杨酸染色液)考马斯亮蓝0.05g,磺基水杨酸20g,加蒸馏水至100mL,过滤后置试剂瓶内保
9、存。1.4脱色液 7%乙酸溶液。1.5保存液 甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL。1.6 1%琼脂(糖)溶液 琼脂(糖)1g,加已稀释10倍的电极冲液,加热溶解,4贮藏,备用。2.操作2.1安装垂直板电泳糟 按照说明书操作。2.2制备凝胶板PAGE有连续体系与不连续体系2种,其灌胶方式不完全相同,分别叙述如下:(1)连续体系本实验采用28Acr-0.735Bis凝胶贮液。从冰箱取出各种贮液,平衡至室温后,按表的配比即(1):(2A):H2O:(3)=l:2:1:4配制20mL 7.0凝胶。前3种溶液混合在小烧杯内,(3)号液单独置另一小烧杯,二者抽气后轻轻混匀,立即用细长头的滴管
10、将分离胶溶液加到凝胶模长、短玻璃板间的狭缝内,当加至距短玻璃板上缘约0.5cm时,停止加胶,轻轻将样品槽模板插入。在上、下贮槽中倒入蒸馏水,液面不能超过上贮槽的短玻璃板,防止蒸馏水进入凝胶中。其作用是增加压力,防止凝胶液渗漏。凝胶液在混合后15min开始聚合,约0.51h,完成聚合作用。聚合后,在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间折射率不同的透明带。看到透明带后继续放置30min再用双手取样品槽模板。取时动作要轻,用力均匀,以防弄破加样凹曹。凹槽中残留液体可用窄滤纸条轻轻吸去,切勿插进凝胶中,应保持加样槽凹边缘平整。放掉上、下贮槽中的蒸馏水。在上、下两个电极槽倒入电极缓冲液,液面应没过短玻璃板上缘
11、约0.5cm。也可以先加电极缓冲液,然后拔出样品槽模板。分离胶预电泳:虽然凝胶90以上聚合,但仍有一些残留物存在,特别是AP可引起某些样品(如酶)钝化或引起人为的效应,因此在正式电泳前,先用电泳的办法除去残留物,这称为预电泳是否进行预电泳则取决于样品的性质。一般预电泳电流为10mA,60min左右即可。2.4电泳打开电泳仪开关,开始时将电压调至80V。待样品进入分离胶时,将电压调至100V。电泳结束时,用不锈钢铲轻轻将一块玻璃板橇开移去,在胶板一端切除一角作为标记,将胶板移至大培养皿。2.5固定、染色木实验采用0.05考马斯亮蓝R250(内含20磷基水杨酸)染色液,染色与固定同时进行,染色液没
12、过胶板,染色30min左右。2.6脱色用7乙酸浸泡漂洗数次,直至背景蓝色褪去。如用50水浴或脱色摇床,则可缩短脱色时间。PAGE电泳结果如下: 离液3离液1离液2六、总结:1、在大蒜SOD的提取与分离过程中:大蒜很难磨碎,最好改用液氮研磨,有利于保存酶的活性。在加入氯仿离心后,提取粗酶溶液时,注意溶液里面在上层清夜下还有一层分层的溶液是不需要的。在加入氯仿混合液时,注意要轻轻搅拌,防止局部过热,影响酶活性。此外实验工具的不精确性可能导致了很大的误差的出现,包括:没有完全干燥的试管和各试管中反映不充分。2、 在测定SOD活力中。(1)、注意实验的原理,在加入酶之前,各个试管都应该先请洗洁精,同时注意实验操作。3、G-250法对蛋白浓度的测定以及PAGE电泳。 (1)、在测定标准蛋白时,由于系统误差,导致5管分光值过大,被剔除了。(2)、在留样蛋白测定时,第一离样稀释了千分之八,二、三离样稀释度都为百分之一,才能在合理范围内测定分光光度值。(3)、PAGE电泳,四个实验组槽均为出现条带。专心-专注-专业