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1、-大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定目的1掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。2了解酶在提取过程中的两个参数:回收率、纯化倍数。试剂大蒜, 磷酸缓冲液(PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3), 氯仿乙醇混合液冷丙酮, 邻苯三酚, 浓盐酸方法1SOD提取:称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞,加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液,研磨搅拌20分钟,使SOD充分溶解,6000rpm离心,弃去沉淀,得上清液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白 :提取液加入1/4体积的氯仿乙醇混合液搅拌10分钟,6000rpm离心15min去沉淀,得粗酶
2、液。(取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积)3.SOD酶的沉淀分离:剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮,搅拌15min,6000rpm离心15min,得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2ml磷酸缓冲液,溶解后在加3ml混匀。6000rpm离心15min,取上清得到SOD酶液。取1ml备用,其余量取体积。2.大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测,1)溶液中可溶性蛋白含量测定:分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 粗酶液稀释:20 酶液稀释:10 蛋白质浓度(mg/ml
3、)=(1.45A280 0.74A260) 稀释倍数计算酶活力单位U/ml=2(OD1-OD2)5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力试验结果记录:1) 试剂管OD1OD2空白管对照管提取液粗酶液酶液光吸收值(A)00.0810.0410.0680.0132)蛋白质含量的测定:提取液粗酶液酶液光吸收值(A)(260nm)0.4350.7600.185光吸收值(A)(280nm)0.3060.5100.1443)提
4、取液:酶活力单位U/ml = 4.0 总活力 U = 41.2 蛋白质浓度(mg/ml)= 6.09 比活力 U/mg = 0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3 总活力 U = 12.78蛋白质浓度(mg/ml)= 3.542 比活力 U/mg = 0.3670酶液:酶活力单位U/ml = 6.8 总活力 U = 65.96 蛋白质浓度(mg/ml)= 0.719比活力 U/mg = 9.4576 4)粗酶液:纯化倍数 = 0.56 回收率 = 0.31 酶液:纯化倍数 = 14.40 回收率 = 1.60实验结果讨论:粗酶液的实验结果较为正确,操作较为得当,试剂添加较为合理。但是酶液的纯化倍数较大,而且,回收率好像不太正确,值偏大,可能是添加试剂时的量不太准确,或可能与添加了过多的石英砂有关。或者是离心时有部分液体渗出导致引入误差。下次实验应多加注意,小心用量与操作细节与步骤,争取桌做得更好!-第 3 页-