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1、高效液相色谱法第一页，本课件共有91页第一第一节 液相色液相色谱仪器器（high performance liquid chromatograph）液相色液相色谱仪（1）第二页，本课件共有91页液相色液相色谱仪（2）第三页，本课件共有91页液相色液相色谱仪（3）第四页，本课件共有91页液相色液相色谱仪（4）第五页，本课件共有91页Agilent 1100Agilent 1100系列高效液相色谱系统系列高效液相色谱系统 第六页，本课件共有91页二、高效液相色二、高效液相色谱法的特点法的特点（feature of HPLCfeature of HPLC）特点特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定
2、有机及生化试：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试 样的高效分离分析方法。样的高效分离分析方法。第七页，本课件共有91页第八页，本课件共有91页高效液相色高效液相色谱法与法与经典液相色典液相色谱法法经典液相柱经典液相柱色谱装置色谱装置高效液相色谱仪高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径流动相驱动方式流动相流速150-200 m重力或低压泵很慢3-10 m高压泵快(1-10mL/min)例：分离例：分离20种氨基酸种氨基酸柱柱长：170 cm柱径：柱径：0.9 cmF：30 mL/ht分离分离:20 h经典柱色典柱色谱HPLCt分离分离：1 h第九页，本课件共有91页慢慢中等中等
3、快快色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液第十页，本课件共有91页液相色谱以液体为流动相，液相色谱以液体为流动相，固定相可以是固定相可以是固体或液体（担载在固体表面），固体或液体（担载在固体表面），与气与气相色谱比，带来一系列变化：相色谱比，带来一系列变化：例如，例如，填充柱气相色谱柱，一般填料的填充柱气相色谱柱，一般填料的尺寸为尺寸为80-10080-100目目，粒度大约是粒度大约是2 2毫米毫米，而，而一般高效液相色谱的一般高效液相色谱的固定相粒度在固定相粒度在2 21010微米微米，因此流动相通过这样一段固定床时，因此流动相通过这样一段固定床时就产生了很高的反压。就产
4、生了很高的反压。第十一页，本课件共有91页由于液体与气体性质的以下差异：由于液体与气体性质的以下差异：溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小10105 5倍左右倍左右液体粘度比气体约大液体粘度比气体约大10102 2倍倍液体表面张力比气体大液体表面张力比气体大10104 4倍左右倍左右液体密度比气体约大液体密度比气体约大10103 3倍倍液体不可压缩液体不可压缩第十二页，本课件共有91页因此，我们通常所说的因此，我们通常所说的高效高效液相色谱，液相色谱，实际也是实际也是高压液高压液相色谱，相色谱，因为没有因为没有很高的压力很高的压力就不可能产生就不可能产生很高
5、的分离效率。很高的分离效率。第十三页，本课件共有91页三、流程及主要部件三、流程及主要部件（process and main assembly of HPLC）1.流程（流程（动画）画）第十四页，本课件共有91页2.主要部件主要部件(1)(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150150350105 Pa350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m10m），），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高 压、高速是高效液相色谱的特点之一。压、高速是高效液相
6、色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。第十五页，本课件共有91页(2)(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置 外梯度外梯度:利用两台高利用两台高压输液泵，将两种不同压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。合后进入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过比例调节阀，将通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。高压泵中混合。第十六页，本课件共有91页(3)进样装置进样装置流
7、路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：第十七页，本课件共有91页(4)(4)高效分离柱高效分离柱高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径1 16 mm6 mm，柱长，柱长5 540 cm40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。柱效。第十八页，本课件共有91页(5)(5)液相色谱检测器液相色谱检测器液相色谱检测器液相色谱检测器a.a.紫外检测器紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物
8、有响应。特点：特点：灵敏度高；灵敏度高；线形范围高；线形范围高；流通池可做的很小流通池可做的很小（1mm 10mm1mm 10mm，容积，容积8L8L）；）；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。第十九页，本课件共有91页一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿 四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长/nm380245212210190205187第二十页，本课件共有91页b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检
9、测器：光电二极管阵列检测器：10241024个二极管阵列，各检测个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第二十一页，本课件共有91页第二十二页，本课件共有91页光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器第二十三页，本课件共有91页c.c.示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detectordifferential refractive index detector）除紫外检测器之外应用除紫外检测器之外应用最多的检测器；最多的检测器；可连
10、续检测参比池和样品可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种。干涉型三种。第二十四页，本课件共有91页示差折光检测器示差折光检测器第二十五页，本课件共有91页d.荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B B、黄
11、曲霉素、卟啉类化合黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响酸、甾类化合物等有响应。应。第二十六页，本课件共有91页17-2 基本理论基本理论一一 色谱柱柱效的基本关系式色谱柱柱效的基本关系式二二 分离度分离度第二十七页，本课件共有91页三三 速率方程速率方程溶质在液相流动相中溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分相中扩散系数的万分之一之一第二十八页，本课件共有91页流流动相流速相流速对板高的影响板高的影响1)1)小颗粒填料，填充均匀；小颗粒填料，填充均匀；2 2)选择较低的流动相流速；选择较低的流动相流速；3)3)选择粘
12、度小的溶剂作流动相，改善传质选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程修正的速率方程：提高柱效提高柱效途径途径第二十九页，本课件共有91页硅胶强极性硅胶强极性氧化铝弱极性氧化铝弱极性活性炭非极性活性炭非极性分子筛强极性分子筛强极性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)(GDX)固体吸附剂固体吸附剂17-3 高效液相色谱分离方法高效液相色谱分离方法一一(液液-固固)吸附色谱法吸附色谱法1.第三十页，本课件共有91页 吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表吸附剂一般为多孔性的物质，在它们的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相面存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的活性
13、中心上进行竞争，同分子在吸附剂表面的活性中心上进行竞争，同时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间时不同溶质之间和同一溶质的不同官能团之间也存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶也存在竞争。竞争的综合结果就是形成不同溶质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。质在吸附剂表面吸附、解吸平衡。2 2 分离原理分离原理第三十一页，本课件共有91页K Kadad值越大，保留时间越长。值越大，保留时间越长。可表式为可表式为：第三十二页，本课件共有91页吸附色谱的分离机理随着样品在固定随着样品在固定相上的吸附能力相上的吸附能力由大到小由大到小在色谱柱上的保在色谱柱上的保留由长到短留由长到短第三十三页，本课件共有91页
14、硅胶表面硅胶表面结构构第三十四页，本课件共有91页硅胶表面硅胶表面结构构经热处理理发生的生的变化化第三十五页，本课件共有91页缺缺 点点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。第三十六页，本课件共有91页极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下：氟碳化合物饱和烃 烯烃芳烃有机卤化物醚硝基化合物腈叔胺酯醛酮醇伯胺酰胺羧酸磺酸第三十七页，本课件共有91页3 3 流动相流动相(洗脱剂洗脱剂)越大，表明流动相溶剂分子对吸越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。剂上将被
15、吸附的溶质洗脱下来。溶剂分子在单位吸附剂表面上的溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能吸附自由能溶剂强度参数溶剂强度参数各种不同极性的一元或多元各种不同极性的一元或多元溶剂。溶剂。第三十八页，本课件共有91页硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯丙苯，丁苯流动相：流动相：干燥正庚烷干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷份水饱和的正庚烷2 2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水饱和的正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的改变流动相的组成可改变分离组成可改变分离的选择性的选择性第三十九页，本课件共有91页4 应用应用具有具有不同官能团的化合物不同官能团的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合
16、物具有相同官能团，但数量不同的化合物异构体异构体例：例：几种取代位置不同的硝基苯几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：顺序：邻位邻位 间位间位 流动相极性流动相极性正相分配色谱正相分配色谱组分组分极性极性越越大大，保留时间保留时间越长越长反相分配反相分配色色谱固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性组分组分极性极性越越小，小，保留时间保留时间越长越长2.2.流流 动动 相相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相对于亲水性固定液，采用疏水性流动相.即：即：当流当流 动相的极性大于固定液的极性时：动相的极性大于固定液的极性时：第四十四页，本课件共
17、有91页固固 定定 相相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。（担体）表面的游离羟基上。如如 C-18C-18柱（反相柱）。（详见后面）柱（反相柱）。（详见后面）第四十五页，本课件共有91页分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水有机溶剂如甲醇、
18、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相反相色谱固定相多为键合相第四十六页，本课件共有91页1 1 固定相固定相阳离子：阳离子：SOSO3 3H(H(强强)COCO2 2H(H(弱弱)阴离子：阴离子：N N+R R3 3(强强)NHNH2 2(弱弱)基基质质合成树脂合成树脂纤维素纤维素硅胶硅胶离子交换剂离子交换剂阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；三三 离子交换色谱法离子交换色谱法第四十七页，本课件共有91页2 2
19、流动相流动相水相缓冲液水相缓冲液+有机改性剂有机改性剂调节选择性的调节选择性的主要参数主要参数盐种类及浓度盐种类及浓度pH值阴离子离子交换树脂作固定相，采用阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；碱性水溶液；第四十八页，本课件共有91页各种阴离子在阴离子交换剂上的滞留次序：各种阴离子在阴离子交换剂上的滞留次序：*用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快第四十九页，本课件共有91页阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换3.3.分离原理分离原理阴离子交换
20、阴离子交换第五十页，本课件共有91页4 4 应用应用离子及可离解的化合物如离子及可离解的化合物如：氨基酸、核酸、蛋白质等氨基酸、核酸、蛋白质等第五十一页，本课件共有91页离子交换树脂的分离机理第五十二页，本课件共有91页离子交换色谱概述适用于离子型化合物的分离适用于离子型化合物的分离分离基于离子的带电特性分离基于离子的带电特性洗脱次序受多种因素的影响洗脱次序受多种因素的影响填料（离子交换树脂）的种类填料（离子交换树脂）的种类阴阴/阳，强阳，强/弱，弱，交换基团交换基团样品分子特性样品分子特性盐的种类、浓度盐的种类、浓度温度及温度及pHpH值值有机溶剂有机溶剂第五十三页，本课件共有91页四、离子
21、色谱四、离子色谱 （ion chromatographyion chromatography）离子色谱是在离子色谱是在2020世纪世纪7070年代中期发展起年代中期发展起来的一中技术，其来的一中技术，其与离子交换色谱的区别与离子交换色谱的区别是是其其采用了特制的、具有极低交换容量采用了特制的、具有极低交换容量的离子的离子交换树脂作为柱填料，并采用交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技淋洗液抑制技术和电导检测器术和电导检测器，是，是测定混合阴离子测定混合阴离子的有效的有效方法。方法。图片图片第五十四页，本课件共有91页二、离子色谱仪器二、离子色谱仪器淋洗液淋洗液 泵色色谱谱柱柱检测检测器器 泵液
22、泵液分离分离 检测检测 记录记录F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-进样阀进样阀抑制器抑制器检测检测池池进样进样第五十五页，本课件共有91页离子色谱基本原理 离子色谱中发生的基本过程就是离离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。子交换色谱。第五十六页，本课件共有91页 在离子色谱的基本组成中，重要的在离子色谱的基本组成中，重要的和与其他高效液相色谱不同的就是抑制和与其他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导检测器。器和电导检测器。第五十七页，本课件共有91页抑制器的作用抑制器的作用废液Back Ground：N
23、a2CO3/NaHCO3(700S)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4Retention timeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4Back Ground：Na2CO3/NaHCO3(700S)Retention timeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4Retention timeBack Ground：H2CO3(15S)Conductivity第五十八页，本课件共有91页阴离子抑制器阴离子抑制器抑制器的作用抑制器的作用淋洗液淋洗液(Na(Na2 2COCO3 3)分析柱分析柱HF,HCI,HHF,H
24、CI,H2 2SOSO4 4 in in H H2 2COCO3 3NaF,NaCl,NaF,NaCl,NaNa2 2SOSO4 4 in Na in Na2 2COCO3 3废液废液H H2 2O O不经过抑制不经过抑制不经过抑制不经过抑制对离子对离子 S S时间时间 S S时间时间经过抑制经过抑制经过抑制经过抑制废液废液H H2 2O OH H+NaNa+1294312943样品样品 F,CI,SOF,CI,SO4 42 2-F FSOSO4 42 2CICI-F FSOSO4 42 2CICI-负极负极正极正极OHOH-第五十九页，本课件共有91页自动连续再生阴离子抑制器中电化学反自动连
25、续再生阴离子抑制器中电化学反应和离子移动应和离子移动NaOH,HNaOH,H2 2H H+废液废液废液废液阳极阳极检测器检测器H H+O+O2 2H H2 2 +OH+OH-H H2 2O OH H2 2O ONaNa+H H+OH+OH-H H2 2O OH H+,X X-H H+,X X-in Hin H2 2O O H H2 2O OH H2 2O OH H2 2O,OO,O2 2阳离子交换膜阳离子交换膜NaNa+,X X-在在 NaOH NaOH 淋洗液中淋洗液中阴极阴极第六十页，本课件共有91页五、离子对色谱五、离子对色谱 （ion pair chromatography）原理原理：
26、将一种（或多种）与溶质离子电：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；进行分配；第六十一页，本课件共有91页阴离子分离阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；钠作为对离子；反相离子对色谱反相离子对色
27、谱：非极性的疏水固定相：非极性的疏水固定相(C-18(C-18柱柱)，含有对离子，含有对离子Y Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为水作为流动相，试样离流动相，试样离 子子X X-进入流动相后，生成疏进入流动相后，生成疏水性离子对水性离子对Y Y+X X-后；在两相间分配。后；在两相间分配。第六十二页，本课件共有91页六六 尺寸排阻尺寸排阻(凝胶凝胶)色谱法色谱法排阻色谱分离示意图排阻色谱分离示意图相对分子质量差别相对分子质量差别大于大于1010的化合物的化合物才可以分离才可以分离1 1 分离原理分离原理第六十三页，本课件共有91页体积排除色谱的分离机理第六十四页，本课件共有91页2 固
28、定相固定相是一种经过交联而具有立体是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。柔软而富于弹性。凝胶凝胶3 流动相流动相不采用改变流动相组成的不采用改变流动相组成的方法控制分离度方法控制分离度第六十五页，本课件共有91页凝胶色谱概述分离基于分子在溶液中的体积大小分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低分离效率低 色谱行为容易预测色谱行为容易预测第六十六页，本课件共有91页分离方法的选择分离方法
29、的选择第六十七页，本课件共有91页七、亲和色谱七、亲和色谱(AC)(AC)（Affinity chromatograph）原理原理：利用生物大分子和利用生物大分子和固定相表面存在的某种特固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性异性亲和力，进行选择性分离。分离。先在载体表面键合上一先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所种具有一般反应性能的所谓间隔臂谓间隔臂(环氧、联胺等环氧、联胺等)，再连接上配基，再连接上配基(酶、抗原酶、抗原等等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。附的生物大分子作用而被保留
30、。改变淋洗液后洗脱。第六十八页，本课件共有91页第三节第三节 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相1.1.液液-液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （1 1）全多孔型担体）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用球体；早期采用100100m m的大颗粒，表面涂渍固定的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多液，性能不佳已不多 见；现采用见；现采用1010m m以下的小以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；颗粒，化学键合制备柱填料；第六十九页，本课件共有91页（2 2）表面多孔型担
31、体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）30304040m m的玻的玻璃微球，表面附着一层厚度为璃微球，表面附着一层厚度为1 12 2m m的的多孔硅胶。多孔硅胶。表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底；第七十页，本课件共有91页二二.化学键合相色谱化学键合相色谱采用化学键合相采用化学键合相的液相色谱的液相色谱1 1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；质快；2 2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；冲击；3 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；4
32、 4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；5 5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；特点特点第七十一页，本课件共有91页 存在着存在着双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；缺点缺点pHpH值不能小于值不能小于3 3第七十二页，本课件共有91页1.键合固定相制合固定相制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pHpH范围：范围：2-8第七十三页，本课件共有91页
33、化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性目前应用最广、性能最佳的固定相；能最佳的固定相；a.a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiSiO OC C b.b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiO OSi Si C C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用广；稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用广；c.c.硅碳键型：硅碳键型：SiSiC C d.d.硅氮键型：硅氮键型：SiSiN N第七十四页，本课件共有91页键合固定相类型键合固定相类型疏水基团疏水基团烷烃（烷烃（C C8 8和和C C1818）、苯基等）、苯基等极性基团极性基团丙氨基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等离子交换基团离子交换基团胺基、
34、季铵盐胺基、季铵盐磺酸、羧酸磺酸、羧酸第七十五页，本课件共有91页2.2.键合相色谱法分类键合相色谱法分类反相键合相色谱反相键合相色谱:常用固定相：常用固定相：C C1818分离对象分离对象非极性非极性中等极性化合物中等极性化合物常用流动相常用流动相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相键合相色谱反相键合相色谱疏溶剂分离机制疏溶剂分离机制固定相极性固定相极性 流动相极性流动相极性离子性键合相色谱离子性键合相色谱 将各种离子交换基团化学键合到硅将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱的固定相。其分离原理与离
35、子交换色谱类同。色谱类同。第七十八页，本课件共有91页例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基十八烷基键合相键合相二醇基键二醇基键合相合相第七十九页，本课件共有91页保留时间：保留时间：例：以例：以ODSODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸没食子酸3,4-3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相:非极性非极性;流动相流动相:极性极性组分极性组分极性:3,4-:3,4-
36、二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸 )甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)第八十五页，本课件共有91页4 4 贮液瓶及流动相贮液瓶及流动相1)1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)2)适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3)3)化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性好，以免破坏固定相。4
37、)4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)5)纯纯度度高高。溶溶剂剂不不纯纯会会增增加加检检测测器器噪噪声声，产产生生伪峰。伪峰。对流动相溶剂对流动相溶剂的一般要求的一般要求第八十六页，本课件共有91页5 5 流速流速 流速大于流速大于0.5 cm/s0.5 cm/s时时,H Hu u曲线是一段斜曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。离度和出峰时间的重要可选择参数。6.6.分离柱分离柱 在高效液
38、相色谱中，分离柱的制备是一在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。备。第八十七页，本课件共有91页三、三、HPLCHPLC的应用的应用 （application of HPLCapplication of HPLC）1 1环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37(37 5050 m)m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm50cm 2.5mm(2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器
39、：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。进行分析。第八十八页，本课件共有91页2.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。固定相：固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相流动相：流动相：20%20%甲醇甲醇-水水100%100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min2%/min 流流 速：速：1mL/min1mL/min 柱柱 温：温：50 50 C C 柱柱 压：压：70 70 104 Pa104 Pa 检测器：检测器：紫外检测器紫外检测器第八十九页，本课件共有91页 液相色谱的定性及液相色谱的定性及定量技术定量技术第九十页，本课件共有91页进一步的确认标准加入标准加入同时用其他方法同时用其他方法其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）柱）其他检测器其他检测器PDAPDA，光谱图比较、谱库检索，光谱图比较、谱库检索MSMS，质谱图解析、谱库检索，质谱图解析、谱库检索其他仪器方法其他仪器方法第九十一页，本课件共有91页